注：本文不構(gòu)成任何投資意見和建議，以官方/公司公告為準；本文僅作醫(yī)療健康相關(guān)藥物介紹，非治療方案推薦（若涉及），不代表平臺立場。任何文章轉(zhuǎn)載需得到授權(quán)。

隨著mRNA新冠疫苗成功，RNA藥物進入快速發(fā)展階段。在全球范圍內(nèi)，RNA療法為各國研究人員擴大藥物開發(fā)靶點范圍提供了獨特機會，其作用靶點的多樣性引起了領(lǐng)先的科研機構(gòu)、新興生物技術(shù)公司和大制藥公司極大關(guān)注。目前有多種不同類型RNA療法在研發(fā)過程中，主要包括反義寡核苷酸（ASO）、小干擾核酸（siRNA）、微小RNA（miRNA）、信使RNA（mRNA）、Aptamer（核酸適配體）等等。作為一類新型藥物治療形態(tài)，可對常規(guī)藥物分子無法靶向的蛋白質(zhì)和基因進行選擇性作用，RNA核酸藥物已經(jīng)在多種疾病中應(yīng)用。

盡管RNA療法研發(fā)取得了非凡進步，還有很多問題和挑戰(zhàn)亟需克服，如RNA高度不穩(wěn)定、體內(nèi)遞送效率低、宿主細胞免疫原性等等。RNA分子以藥物或靶向RNA小分子形式直接用于治療兩種模式。RNA藥物可利用內(nèi)源性調(diào)節(jié)機制，并可特異性調(diào)節(jié)目標靶點。RNA藥物須通過細胞膜并具有結(jié)合細胞內(nèi)靶標能力，并調(diào)控基因表達，進而實現(xiàn)相關(guān)蛋白質(zhì)表達調(diào)節(jié)。

蛋白質(zhì)表達水平檢測是藥理藥效研究非常重要的方面，目前有多種技術(shù)可以實現(xiàn)不同基質(zhì)中分泌型和內(nèi)源性蛋白質(zhì)定量分析，例如ELISA技術(shù)，LC-MS技術(shù)、Western Blot技術(shù)等，也有一些創(chuàng)新性技術(shù)逐步被主流核酸藥物公司所采用，本文將介紹核酸藥物領(lǐng)導(dǎo)者采用全自動毛細管Digital Western技術(shù)（也稱Simple Western技術(shù)）解決研發(fā)中蛋白質(zhì)分析問題。

?案例一

Moderna—臨床前動物模型中蛋白質(zhì)表達定量技術(shù)

Moderna公司目前在研臨床I期mRNA療法，mRNA-3927用于治療丙酸血癥（Propionic acidemia，PA）。

臨床前小鼠動物模型研究表明，雙RNA療法可恢復(fù)代謝功能。丙酸血癥是一種線粒體酶丙酰輔酶A羧化酶(PCC)缺乏引起固有代謝紊亂，PCC由六個α(PCCA)和六個β(PCCB)亞基組成。采用編碼人類PCCA和PCCB的雙mRNA組合，裝載在可生物降解脂質(zhì)納米顆粒（LNP）中，在肝臟中可產(chǎn)生功能性PCC酶。

雙mRNA編碼的蛋白質(zhì)比單獨mRNA具有更高PCC酶活性。下圖a-c是比較雙RNA共轉(zhuǎn)染與hPCCA或hPCCB mRNA單獨轉(zhuǎn)染數(shù)據(jù)。a和d圖是酶活性評估，b和c圖是采用毛細管Digital Western定量檢測患者成纖維細胞中PCCA和PCCB蛋白質(zhì)表達。

?案例二

Arcturus Therapeutics—組織中定量檢測hOTC表達

Arcturus Therapeutics公司臨床階段mRNA療法ARCT-810用于治療鳥氨酸氨甲?；D(zhuǎn)移酶缺乏癥?(Ornithine Transcarbamylase Deficiency, OTCD)。該疾病是尿素循環(huán)障礙中最常見的一種遺傳性代謝病，OTC基因突變會導(dǎo)致高氨血癥發(fā)作。

脂質(zhì)納米顆粒（LNP）裝載的OTC mRNA（LUNAR-OTC mRNA）利用專有的脂質(zhì)藥物介導(dǎo)技術(shù)，可安全高效地將OTC mRNA遞送到肝細胞內(nèi)，使患者自身肝細胞內(nèi)能自然產(chǎn)生功能正常的OCT酶。進而，臨床前小鼠模型研究中，通過測量OTC-mRNA藥物處理后小鼠肝臟和血漿中OTC酶活性和蛋白質(zhì)表達，來反映LUNAR-OTC mRNA藥物在小鼠模型中藥效。

人鳥氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶?(hOTC) 在小鼠肝臟中蛋白表達。使用全自動毛細管Digital Western（Jess, Simple Western）系統(tǒng)定量檢測小鼠肝臟中hOTC 蛋白表達，以重組蛋白為校正曲線來進行定量。使用抗人OTC抗體，從四個遞增劑量組觀察到明顯的劑量反應(yīng)，在未治療OTC缺陷組或未治療野生型組中未檢測到hOTC蛋白。OTC蛋白表達水平與肝臟樣本中OTC活性有很好的相關(guān)性。

?案例三?

Ionis Pharmaceuticals--ASO抑制RBM20可改善心力衰竭功能

射血分數(shù)（測量每次心臟收縮時離開心臟的血液百分比）保留的心力衰竭（HFpEF）是普遍和致命的。目前為止，沒有很好的靶向治療藥物。病因之一是心室充盈受損，德國馬克斯-德爾布呂克分子醫(yī)學(xué)中心和Ionis Pharmaceuticals科學(xué)家使用靶向心臟剪接因子RBM20的反義寡核苷酸（ASO）可改善其功能。

在比剛度增加的成年小鼠中，2個月內(nèi)每周給ASO可增加順應(yīng)性肌動蛋白異構(gòu)體表達，并改善心臟功能。人類工程心臟組織中驗證結(jié)果顯示，在ASO治療3周內(nèi)RBM20表達下調(diào)至不到50%，導(dǎo)致沒有心臟病理狀況下適應(yīng)性松弛動力學(xué)。本研究表明，抗RBM20 ASO可作為強大的心臟剪接調(diào)節(jié)劑，治療人類HFpEF。

注射RBM20 ASO有效抑制小鼠心臟RBM20表達。(B)圖是小鼠體內(nèi)實驗設(shè)計，(C)用PBS或ASO處理的野生型(WT)和N2B敲除 (KO) 小鼠心臟組織中的Rbm20 mRNA表達，（D和E）采用全自動毛細管Digital Western檢測相應(yīng)的RBM20蛋白表達豐度。mRNA和蛋白表達分子水平上，RBM20表達豐度下調(diào)50%以上。

Digital Western技術(shù)

加快核酸藥物開發(fā)

以上Moderna、Arcturus Therapeutics和Ionis Pharmaceuticals三個案例是Digital Western代表案例，此技術(shù)已經(jīng)廣泛被RNA藥物領(lǐng)域領(lǐng)導(dǎo)者采用。如mRNA藥物領(lǐng)域的Moderna、BioNtech和CureVac等，ASO方面Ionis Pharmaceuticals、Sarepta等，siRNA領(lǐng)域Alnylam、Dicerna和Arrowhead等，saRNA領(lǐng)域MiNA Therapeutics和中美瑞康等采用，及其他RNA療法公司。

全自動數(shù)字化蛋白質(zhì)表達定量分析系統(tǒng) (Digital Western) 是美國Bio-Techne集團旗下蛋白質(zhì)分析品牌ProteinSimple所有。全自動毛細管Digital Western技術(shù)作為創(chuàng)新性毛細管電泳免疫學(xué)技術(shù)，將Western Blot技術(shù)和ELISA技術(shù)合二為一，可利用微量組織樣本實現(xiàn)內(nèi)源性蛋白質(zhì)精準的相對定量和絕對定量。作為創(chuàng)新型生物分析方法，其具備傳統(tǒng)Western Blot蛋白質(zhì)分子量可視化優(yōu)勢，定性更準確，同時具備ELISA和質(zhì)譜技術(shù)精準定量性能，其靈敏度和精密度符合高標準生物分析要求。Digital WB自動化程度高，重復(fù)性好，靈敏度高和具有較寬動態(tài)檢測范圍，這些特點滿足核酸藥物研發(fā)不同階段的目的蛋白定量需求，加快核酸藥物研發(fā)。