通常，在科學(xué)實(shí)驗(yàn)中，我們會(huì)對(duì)所研究的目的基因進(jìn)行表達(dá)分析，常用的方法有實(shí)時(shí)熒光定量PCR法（qRT-PCR）。有些做RNA-seq的小伙伴，在做完轉(zhuǎn)錄組分析之后，一般也都會(huì)要求做qRT-PCR來驗(yàn)證二代測(cè)序得到的轉(zhuǎn)錄本表達(dá)是否可靠。這里我們講一下常用的Livak法(2^-??Ct法)是如何計(jì)算的，以及在qRT-PCR中常見問題和解決方案。

qRT-PCR的原理：

以基因的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，在PCR擴(kuò)增過程中，熒光信號(hào)的強(qiáng)度與擴(kuò)增產(chǎn)物的數(shù)量成正比。通過實(shí)時(shí)檢測(cè)PCR擴(kuò)增過程中熒光信號(hào)的變化，可以獲得關(guān)于相對(duì)定量基因表達(dá)水平的信息。qRT-PCR一般包括SYBR染料法和Taqman探針法。例如，SYBR染料游離時(shí)發(fā)出的熒光信號(hào)微乎其微，但當(dāng)其與雙鏈DNA的小溝結(jié)合后，熒光信號(hào)強(qiáng)度會(huì)大大增加，表明雙鏈DNA總量也發(fā)生了很大變化。在qRT-PCR實(shí)驗(yàn)中，Ct值表示每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)達(dá)到預(yù)設(shè)閾值的周期數(shù)（cycle）。

擴(kuò)增曲線及溶解曲線如下圖所示：

擴(kuò)增曲線主要用于評(píng)估擴(kuò)增引物的效率。當(dāng)使用引物特異性較好時(shí)，擴(kuò)增曲線呈現(xiàn)出單一峰值，這樣的實(shí)驗(yàn)結(jié)果更加可靠。

一、Livak法的詳細(xì)步驟：

在這里，我們有一個(gè)對(duì)照組（wt），一個(gè)處理組（mut），還有一個(gè)內(nèi)參基因（ATCB）和目的基因（OCA2），希望比較處理組與對(duì)照組中目標(biāo)基因的相對(duì)表達(dá)差異，也就是計(jì)算2^-??Ct，數(shù)據(jù)如下圖所示：

1.?計(jì)算每個(gè)組內(nèi)參基因（ATCB）Ct值的均值

2.?計(jì)算每組中待檢目的基因的Ct值與內(nèi)參基因的Ct值之差（即?Ct）

3.?計(jì)算對(duì)照wt組中?Ct值的均值，然后將處理mu組中每個(gè)樣本的?Ct值減去對(duì)照wt組的?Ct 均值，以得到??Ct值

4.?進(jìn)行相對(duì)表達(dá)量計(jì)算，即將處理mu組相對(duì)于對(duì)照wt組的??Ct值作為指數(shù)，并計(jì)算2的負(fù)冪次方（2^-??Ct）

二、常見問題和解決方案：

1、擴(kuò)增曲線中Ct值出現(xiàn)過晚

① cDNA模板降解或cDNA模板濃度低：Ct值越晚，表示內(nèi)參基因和目的基因序列起始濃度越低?？梢灾匦轮苽鋍DNA模板重復(fù)實(shí)驗(yàn)，以及減少cDNA模板稀釋倍數(shù)重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

② 擴(kuò)增效率低：引物或探針的設(shè)計(jì)可能特異性不強(qiáng)，導(dǎo)致擴(kuò)增效率低。確保引物或探針的設(shè)計(jì)準(zhǔn)確，避免與非目標(biāo)序列的非特異性結(jié)合?？梢灾匦略O(shè)計(jì)引物或者優(yōu)化PCR反應(yīng)條件，比如在qRT-PCR中使用三步法擴(kuò)增程序。

③ PCR體系中存在抑制物：樣品中可能存在PCR反應(yīng)抑制物，如殘余酚類物質(zhì)、碳水化合物、鹽（胍鹽）等。這些抑制物可能會(huì)降低PCR效率，導(dǎo)致Ct值偏高。一般來說，純度好的RNA，A260 / A280比值應(yīng)大于2.0，如果比值低于2.0，則表示存在蛋白質(zhì)或者酚類物質(zhì)的影響。確保在樣品制備過程中使用純凈的試劑和采用可以提取高質(zhì)量RNA的方法，以去除或稀釋潛在的抑制物。

2、在qRT-PCR實(shí)驗(yàn)中，內(nèi)參基因的Ct值正常，而目的基因的Ct值出現(xiàn)較晚

① 目的基因的表達(dá)水平較低：如果目的基因的表達(dá)水平較低，PCR擴(kuò)增需要更長的時(shí)間才能達(dá)到設(shè)定的熒光閾值，因此Ct值會(huì)出現(xiàn)較晚。在這種情況下，為了準(zhǔn)確測(cè)量目的基因的表達(dá)水平，內(nèi)參基因的模板和目的基因的模板應(yīng)該分開進(jìn)行稀釋（內(nèi)參基因和目的基因都有其特定的濃度范圍，過低或過高的濃度都可能導(dǎo)致結(jié)果的不準(zhǔn)確性）。也可以使用數(shù)字PCR儀檢測(cè)。

② PCR擴(kuò)增得率低：引物和目的基因序列之間的特異性匹配可能存在問題，導(dǎo)致擴(kuò)增效率低。可以設(shè)計(jì)多對(duì)引物，從中選擇最優(yōu)的。

3、熔解曲線呈現(xiàn)非單一峰

① 非特異性擴(kuò)增：當(dāng)PCR反應(yīng)條件不夠好或引物與非目的基因序列匹配時(shí)，可能會(huì)導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物的形成。這種情況下，熔解曲線可能顯示出多個(gè)峰?？赏ㄟ^優(yōu)化PCR反應(yīng)條件（進(jìn)行溫度梯度PCR實(shí)驗(yàn)，嘗試不同溫度和延伸時(shí)間）、根據(jù)引物設(shè)計(jì)原則來設(shè)計(jì)新的引物等方法以增加特異性。

② 引物二聚體：引物對(duì)之間的非特異性結(jié)合，導(dǎo)致在熔解曲線上出現(xiàn)額外的峰，通常位于75℃左右。在qRT-PCR反應(yīng)結(jié)束后，可以通過瓊脂糖凝膠電泳確認(rèn)引物二聚體?？梢酝ㄟ^適當(dāng)減低引物濃度以避免。

③ 在qRT-PCR中有基因組污染：重新制備cDNA模板即可

4、實(shí)驗(yàn)重復(fù)性很差

① 移液槍不準(zhǔn)，加樣不準(zhǔn)確：這種情況下，可以更換最佳使用量程的性能更好的移液槍，并定期對(duì)移液槍進(jìn)行校準(zhǔn)。

② 定量PCR儀在不同位置溫度不一樣：為獲取準(zhǔn)確的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，定量PCR儀應(yīng)定期進(jìn)行校準(zhǔn)。

③ qRT-PCR預(yù)混液未混合均勻：可以輕輕顛倒裝有qRT-PCR預(yù)混液的離心管來促進(jìn)混合。注意應(yīng)避免劇烈搖動(dòng)或振蕩，以免引起氣泡的形成。

以上提供的是qRT-PCR相對(duì)定量分析的詳細(xì)步驟以及常見問題和解決方案，希望能對(duì)小伙伴們有所幫助！關(guān)注漢恒生物，如果您對(duì)于qRT-PCR實(shí)驗(yàn)還有任何疑問，都可以跟我聯(lián)系！

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