二、分子生物學(xué)方法

1. 噬菌體展示技術(shù)

噬菌體展示技術(shù)是在深刻理解噬菌體遺傳學(xué)和生理學(xué)特性的基礎(chǔ)上產(chǎn)生的。其原理是將蛋白質(zhì)文庫整合到一個簡單的噬菌體顆粒中，利用目的蛋白質(zhì)與特異配基的親和力，篩選和配基特異結(jié)合的蛋白質(zhì)。噬菌體展示技術(shù)一般要經(jīng)過多輪的篩選，這樣就可以得到在文庫中含量很低的與配基特異作用的蛋白質(zhì)。

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2. 酵母雙雜交

1989年Field等發(fā)明了酵母雙雜交系統(tǒng)。該系統(tǒng)利用了酵母的生長轉(zhuǎn)錄因子GAL4含有的兩個結(jié)構(gòu)域， DNA 結(jié)合域（DNA binding domain， BD）及轉(zhuǎn)錄激活域（DNA activating domain，AD），將已知基因（誘餌基因）和靶基因或含有靶基因的cDNA分別構(gòu)建在含BD及AD質(zhì)粒載體上，當(dāng)這兩種質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)化酵母感受態(tài)細(xì)胞，若BD結(jié)合的誘餌蛋白能夠與AD結(jié)合的靶蛋白或文庫中某些cDNA編碼的蛋白相互作用、彼此間結(jié)合時，則會導(dǎo)致位于側(cè)翼的BD與AD在空間上接近，呈現(xiàn)GAL4轉(zhuǎn)錄因子的完全活性，啟動下游的報告基因如His及LacZ等基因的表達(dá)，從而在特定的缺陷培養(yǎng)基上生長。

因此，利用酵母雙雜交系統(tǒng)能夠篩選與誘餌蛋白相互作用的蛋白，還可以研究已知蛋白間的相互作用。利用酵母雙雜交技術(shù)篩選cDNA文庫分離與誘餌蛋白相互作用的蛋白或研究蛋白間的相互作用，一般首先考慮的問題是誘餌載體的構(gòu)建。編碼誘餌蛋白的基因經(jīng)酶切處理后，按照正確的讀碼框與誘餌載體如pGBTK7相連接，再經(jīng)酶切或測序做進(jìn)一步的驗證分析。

????構(gòu)建好誘餌載體還要同時轉(zhuǎn)化誘餌蛋白酵母菌株如Y187和靶蛋白酵母菌株如AH109，進(jìn)行毒性和自激活性檢測，證明誘餌蛋白的表達(dá)對酵母正常生長沒有毒性，同時也不能自身激活酵母報告基因的表達(dá)，可用于篩選文庫或研究蛋白間的相互作用。第二個要考慮的問題就是靶蛋白載體或酵母雙雜cDNA文庫的構(gòu)建。

????一般在編碼靶蛋白的基因或cDNA兩端加上同源重組序列，然后與靶蛋白載體如pGADT72Rec共同轉(zhuǎn)化靶蛋白酵母菌株如AH109，在酵母同源重組酶的作用下，靶蛋白基因或cDNA序列整合到載體上，完成靶蛋白載體或cDNA文庫的構(gòu)建。最后一步就是篩選文庫或直接研究兩個蛋白間的相互作用。

???分別含有誘餌蛋白載體和靶蛋白載體的酵母雜交后，在酵母體內(nèi)融合表達(dá)BD誘餌和AD靶蛋白。誘餌蛋白和靶蛋白的相互作用，導(dǎo)致位于側(cè)翼的BD與AD在空間上接近，呈現(xiàn)GAL4轉(zhuǎn)錄因子的完全活性，啟動下游的報告基因如His及LacZ等基因的表達(dá)，根據(jù)報告基因的表達(dá)情況，從而達(dá)到分離蛋白或研究蛋白互作的目的。

三、遺傳學(xué)技術(shù)

合成致死篩選

合成致死效應(yīng)是指兩個基因同時發(fā)生突變時會產(chǎn)生致死效應(yīng)，而當(dāng)每個基因單獨發(fā)生突變時，則無致死效應(yīng)。這總遺傳學(xué)方法可以用于分析兩個育幼相同重要功能的蛋白之間的相互作用。由于合成致死突變株是不能存活的，不能直接得到致死菌株，因此，在實驗室中多使用條件突變菌株。如溫度敏感菌株是可以在某些溫度條件下致死的突變型。合成致死篩選所得到的兩種相互作用蛋白可能是同一復(fù)合物的兩種組分或是一種蛋白對另一種蛋白所有的調(diào)節(jié)作用。

四、展望

蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展促進(jìn)了多種研究技術(shù)的開發(fā)和完善，越來越多的技術(shù)趨向于大規(guī)模、高通量方向發(fā)展。同時，物理學(xué)、化學(xué)、信息學(xué)等基礎(chǔ)學(xué)科研究的發(fā)展也大大促進(jìn)了這些技術(shù)的改進(jìn)。

????新近發(fā)展的計算機(jī)分析方法，以基因序列和基因組信息為基礎(chǔ)預(yù)測蛋白質(zhì)相互作用，并涉及對參與蛋白質(zhì)相互作用的表面殘基的預(yù)測。

????依賴基因序列來分析蛋白質(zhì)相互作用的分析方法正在形成。而這些先進(jìn)的、簡易的、大規(guī)模分析蛋白質(zhì)相互作用的技術(shù)發(fā)展又推動了蛋白質(zhì)組學(xué)的進(jìn)步。可以預(yù)見在不久的將來，隨著基因組研究和蛋白質(zhì)組學(xué)的不斷深入，生命科學(xué)中的種種疑難將被逐一攻破。

（附：遺傳學(xué)技術(shù)，在前面有一期詳細(xì)介紹過喔，想了解的可以往前翻）