寫在前面

????????今天推薦的是由美國德克薩斯大學(xué)MD安德森癌癥中心團(tuán)隊(duì)在2018年12月13日發(fā)表于? ? CancerResearch（IF：9.078 JCR 1區(qū)）的一篇文章，通訊作者是SuyunHuang教授，研究表明β-catenin/USP1/EZH2信號(hào)調(diào)控軸的異常是導(dǎo)致神經(jīng)膠質(zhì)瘤形成的關(guān)鍵因素。

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研究背景

????????Wnt/β-catenin信號(hào)途徑高度保守，在動(dòng)物胚胎發(fā)育、器官形成等生理過程中都發(fā)揮重要作用。該信號(hào)由Wnt配體結(jié)合后激發(fā)，導(dǎo)致Frizzled和LRP受體共同激活，接著β-catenin入核與轉(zhuǎn)錄因子TCF/LEF結(jié)合，從而激活下游基因表達(dá)。在多種癌癥中都有發(fā)現(xiàn)過度激活的β-catenin信號(hào)。異常的β-catenin激活在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中普遍存在，是該腫瘤發(fā)生的關(guān)鍵，但這種異常激活導(dǎo)致腫瘤形成的隱藏機(jī)制還未得到完全揭示。

????????EZH2是PcG（Polycomb group）復(fù)合物的催化亞基，可介導(dǎo)組蛋白H3K27的三甲基化而參與特定基因的轉(zhuǎn)錄抑制。EZH2的過表達(dá)在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中很常見，且與腫瘤的侵略性和晚期發(fā)展相關(guān)。EZH2的致癌作用很大程度上是通過介導(dǎo)H3K27三甲基化而導(dǎo)致表觀遺傳沉默，從而抑制下游腫瘤抑制基因的表達(dá)。EZH2可通過蛋白酶體泛素化途徑被降解，研究發(fā)現(xiàn)多種E3連接酶可在不同生物學(xué)環(huán)境中介導(dǎo)EZH2的降解。

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摘要部分

????????本研究中，作者證明了β-catenin信號(hào)傳導(dǎo)在EZH2調(diào)控中的關(guān)鍵作用。作者發(fā)現(xiàn)β-catenin會(huì)誘導(dǎo)USP1的表達(dá)，USP1與EZH2相互作用并使其去泛素化，從而防止EZH2被降解。因此被激活的β-catenin會(huì)使得EZH2處于穩(wěn)定狀態(tài)，從而抑制下游腫瘤抑制基因的表達(dá)，也促進(jìn)了神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖和腫瘤的進(jìn)展。本研究揭示的β-catenin–USP1-EZH2信號(hào)調(diào)控軸將超活化的β-catenin信號(hào)傳導(dǎo)和EZH2介導(dǎo)的表觀遺傳基因沉默聯(lián)系了起來，這是神經(jīng)膠質(zhì)瘤腫瘤發(fā)生的關(guān)鍵機(jī)制。

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研究?jī)?nèi)容

1.β-catenin通過抑制EZH2蛋白的泛素化而使其穩(wěn)定
????????為了研究β-catenin對(duì)EZH2表達(dá)的影響，作者檢測(cè)了β-catenin野生型（β-catenin+/+）和敲除（β-catenin-/-）的MEF（小鼠胚胎成纖維細(xì)胞）中的EZH2蛋白水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)與β-catenin+/+相比，β-catenin-/-中EZH2蛋白水平下降，也導(dǎo)致其中的組蛋白H3K27me3水平降低。作者發(fā)現(xiàn)，在SW1783和正常人星形膠質(zhì)細(xì)胞中，持續(xù)激活的β-catenin–S33Y突變體的過表達(dá)上調(diào)了EZH2蛋白水平。使用β-catenin siRNA在患者的GSC11細(xì)胞中進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了這一結(jié)果。但是，β-catenin對(duì)EZH2 mRNA水平?jīng)]有明顯影響，這表明β-catenin調(diào)控了EZH2轉(zhuǎn)錄后的表達(dá)。? ? ? ?

????????為了探究β-catenin是否可以調(diào)控EZH2蛋白的穩(wěn)定性，作者檢測(cè)了經(jīng)過環(huán)己酰亞胺處理的β-catenin+/+和β-catenin-/-MEF中EZH2的豐度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在缺失β-catenin的情況下，EZH2的穩(wěn)定性大大降低，而持續(xù)激活的β-catenin–S33Y的過表達(dá)促進(jìn)了EZH2蛋白的穩(wěn)定性。接著作者又研究了β-catenin對(duì)EZH2泛素化的影響，結(jié)果表明β-catenin–S33Y的過表達(dá)可以抑制SW1783細(xì)胞中EZH2的泛素化而使其不被降解。??

研究結(jié)論：β-Catenin可以抑制EZH2的泛素化，從而維持其蛋白穩(wěn)定。

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2.USP1可以穩(wěn)定膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞中的EZH2蛋白? ? ??
????????作為泛素化的反向過程，蛋白質(zhì)去泛素對(duì)于調(diào)控蛋白質(zhì)循環(huán)十分關(guān)鍵。為鑒定出EZH2的去泛素化酶（DUB），作者篩選了23個(gè)在原癌基因或中樞神經(jīng)系統(tǒng)中高表達(dá)的DUB。作者用環(huán)己酰亞胺處理HEK293T，結(jié)果發(fā)現(xiàn)去泛素化酶USP1，USP11，USP16和USP29會(huì)上調(diào)EZH2蛋白的水平。接著作者又進(jìn)一步研究了這些DUBs對(duì)EZH2泛素化的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，四個(gè)DUB中只有USP1顯著降低了EZH2蛋白的泛素化水平，這表明USP1可以充當(dāng)EZH2的去泛素化酶。? ? ?
????????接下來，作者評(píng)估了USP1對(duì)EZH2蛋白穩(wěn)定性的影響。通過蛋白質(zhì)印跡結(jié)果可知，U87MG和GSC11細(xì)胞中USP1的敲低導(dǎo)致了EZH2蛋白水平的下降。免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，HEK293T和SW1783細(xì)胞中USP1過表達(dá)顯著上調(diào)了EZH2蛋白水平，而USP1缺失的細(xì)胞中EZH2幾乎消失。但是，USP1對(duì)EZH2 mRNA水平?jīng)]有影響。與此結(jié)果一致的是，在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中，EZH2的表達(dá)與USP1的表達(dá)呈正相關(guān)。

研究結(jié)論：USP1可以調(diào)控膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞中的EZH2蛋白水平使其維持穩(wěn)定。

3.USP1與EZH2直接相互作用并使其去泛素化

????????接下來，作者檢測(cè)了USP1和EZH2之間的相互作用。免疫共沉淀結(jié)果顯示，在過表達(dá)USP1與EZH2兩種蛋白的HEK293T細(xì)胞中此二蛋白有相互作用。此外，內(nèi)源性USP1和EZH2在U87MG和GSC11細(xì)胞中有相互作用。為了定位EZH2中相互作用的蛋白質(zhì)區(qū)域，作者構(gòu)建了表達(dá)一系列EZH2缺失突變體的質(zhì)粒，結(jié)果發(fā)現(xiàn)EZH2的SANT結(jié)構(gòu)域的第310-484位殘基是其與USP1相互作用所必需的。

????????作者接下來評(píng)估了USP1對(duì)EZH2泛素化的影響。野生型USP1的過表達(dá)顯著降低了EZH2的泛素化，進(jìn)一步表達(dá)WDR48（一種增強(qiáng)USP1活性的USP1結(jié)合伴侶分子）增強(qiáng)了這種作用。但是，僅WDR48的過表達(dá)并不能顯著降低內(nèi)源性EZH2的泛素化。另外，使用兩個(gè)獨(dú)立的shRNA敲低內(nèi)源性USP1會(huì)促進(jìn)GSC11和U87MG細(xì)胞中的EZH2泛素化。為研究USP1是否直接去泛素化EZH2的問題，作者從HEK293T細(xì)胞中純化泛素化的EZH2，并與USP1和WDR48蛋白一起孵育。結(jié)果顯示USP1/WDR48抑制了EZH2泛素化，并且抑制效率隨著體系中的USP1/WDR48蛋白量的增加而提高。

?研究結(jié)論：USP1直接與EZH2發(fā)生蛋白相互作用，并通過去泛素化發(fā)揮調(diào)控作用。

4.β-catenin通過激活USP1轉(zhuǎn)錄促進(jìn)EZH2的穩(wěn)定性

????????為探究USP1的表達(dá)是否受β-catenin調(diào)節(jié)，作者首先利用癌癥基因組圖譜（TCGA）數(shù)據(jù)調(diào)查了膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中β-catenin、TCF4和USP1的mRNA表達(dá)水平。作者發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中USP1的mRNA分別與β-catenin和TCF4的mRNA水平線性相關(guān)，且在所有亞型中都觀察到β-catenin與USP1表達(dá)水平的線性相關(guān)性。作者還發(fā)現(xiàn)，β-catenin-S33Y的轉(zhuǎn)染顯著提高了SW1783和NHA細(xì)胞中USP1的mRNA水平，而β-catenin-/-MEF中USP1的mRNA水平下降。這些結(jié)果均表明，β-catenin激活了USP1的轉(zhuǎn)錄。? ? ?

????????接著，作者搜索了USP1的啟動(dòng)子區(qū)域，發(fā)現(xiàn)了一個(gè)潛在的LEF/TCF結(jié)合序列，這個(gè)序列位于轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游2,000 bp附近。另外，ChIP分析表明，在Wnt3a處理?xiàng)l件下，β-catenin與USP1啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合并且結(jié)合能力增強(qiáng)。為了進(jìn)一步確定β-catenin對(duì)USP1的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，作者構(gòu)建了兩個(gè)USP1啟動(dòng)子報(bào)告基因Pro-L和Pro-S，其中Pro-S缺少上游TCF4結(jié)合元件。報(bào)告基因檢測(cè)顯示，與Pro-S相比，Pro-L對(duì)Wnt3a和β-catenin信號(hào)的反應(yīng)更大。

????????作者進(jìn)一步評(píng)估了β-catenin對(duì)USP1和EZH2蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果顯示，不同神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中β-catenin的表達(dá)均與USP1和EZH2呈正相關(guān)。在Wnt3a處理下，SW1783和NHA細(xì)胞中USP1和EZH2表達(dá)水平均有上調(diào)，而使用shRNA敲低U87MG細(xì)胞中的β-catenin可顯著下調(diào)USP1和EZH2蛋白的表達(dá)。此外，β-catenin-/-MEF中的EZH2表達(dá)水平降低，而在β-catenin-/-MEF中過表達(dá)USP1可使得EZH2水平恢復(fù)。

研究結(jié)論：β-catenin激活USP1的轉(zhuǎn)錄，從而促進(jìn)神經(jīng)膠質(zhì)瘤中EZH2蛋白的表達(dá)。

5.USP1穩(wěn)定EZH2蛋白會(huì)使下游基因表達(dá)被抑制

????????通過催化組蛋白H3K27me3的形成，EZH2可以抑制一系列與膠質(zhì)母細(xì)胞瘤致瘤特性相關(guān)的抑癌基因，包括CDKN1B，RUNX3和HOXA5。因此，作者評(píng)估了USP1對(duì)EZH2介導(dǎo)基因表達(dá)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，USP1的敲低顯著降低了CDKN1B，RUNX3和HOXA5的啟動(dòng)子對(duì)EZH2的招募效果，這也導(dǎo)致了H3K27me3水平降低。然后，作者檢測(cè)了在β-catenin/USP1/EZH2中EZH2的靶基因的mRNA豐度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在GSC11細(xì)胞中，敲低β-catenin/USP1/EZH2可以上調(diào)這些基因的mRNA與蛋白水平。? ?? ?

????????為了進(jìn)一步研究USP1-EZH2信號(hào)軸對(duì)靶蛋白表達(dá)的影響，作者構(gòu)建了一個(gè)EZH2變體ND-EZH2（不可降解的EZH2），該變體可抵抗蛋白酶體介導(dǎo)的蛋白降解。考慮到EZH2的421殘基位于與USP1相互作用的310-484區(qū)域內(nèi)，USP1可能是通過逆轉(zhuǎn)EZH2泛素化來穩(wěn)定EZH2。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，過表達(dá)ND-EZH2可以抵消USP1敲低對(duì)RUNX3，HOXA5和p27表達(dá)水平的影響。

?研究結(jié)論：USP1通過穩(wěn)定EZH2來促進(jìn)EZH2介導(dǎo)的對(duì)下游基因表達(dá)的抑制。

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6.β-catenin/USP1/EZH2信號(hào)調(diào)控軸促進(jìn)神經(jīng)膠質(zhì)瘤的形成???? ?

????????作者進(jìn)一步研究β-catenin–USP1-EZH2信號(hào)軸在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和腫瘤發(fā)生中的作用。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，β-catenin/USP1/EZH2在GSC11細(xì)胞中的敲低顯著抑制了細(xì)胞增殖，并且ND-EZH2的過表達(dá)幾乎完全逆轉(zhuǎn)USP1敲低造成的影響。接著作者又探索確定β-catenin/USP1/EZH2對(duì)細(xì)胞增殖的影響是否是由細(xì)胞周期分布的變化引起。結(jié)果顯示，SW1783細(xì)胞中Wnt3a的過量生產(chǎn)顯著降低G0–G1期細(xì)胞比例，并增加了G2–M期細(xì)胞比例。USP1敲低抵消了這種效應(yīng)，而ND-EZH2的重組表達(dá)可以恢復(fù)這種效應(yīng)。

????????為研究β-catenin–USP1-EZH2信號(hào)軸在體內(nèi)腫瘤形成中的作用，作者將神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞顱內(nèi)注射到裸鼠中。結(jié)果顯示，源自低級(jí)神經(jīng)膠質(zhì)瘤的SW1783細(xì)胞沒有在裸鼠中形成腫瘤，但Wnt3a在細(xì)胞中的過表達(dá)顯著促進(jìn)了腫瘤的生長(zhǎng)，并且USP1/EZH2的敲低大大抑制了這種作用。這表明Wnt/β-catenin–USP1-EZH2信號(hào)軸可能在神經(jīng)膠質(zhì)瘤向膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的惡性轉(zhuǎn)變中起重要作用。

????????接下來，作者評(píng)估了β-catenin/USP1/EZH2信號(hào)軸對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤小鼠存活的影響。與對(duì)照組相比，SW1783細(xì)胞中Wnt3a的過表達(dá)縮短了受植入小鼠的存活時(shí)間，而敲低USP1/EZH2消除了這種效應(yīng)。此外，β-catenin/USP1/EZH2的敲低顯著延長(zhǎng)了GSC11膠質(zhì)母細(xì)胞瘤小鼠的生存時(shí)間，而ND-EZH2的重組表達(dá)完全逆轉(zhuǎn)了USP1敲低對(duì)小鼠存活的影響。

?研究結(jié)論：β-catenin–USP1-EZH2信號(hào)軸在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和腫瘤發(fā)生中起關(guān)鍵作用。

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7.神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者樣品中USP1表達(dá)的上調(diào)與β-catenin的激活和EZH2水平相關(guān)

????????為確定研究的臨床相關(guān)性，作者分析了30個(gè)II級(jí)和III級(jí)星形細(xì)胞瘤和50個(gè)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤標(biāo)本切片的β-catenin/USP1/EZH2蛋白的表達(dá)。USP1的表達(dá)水平分別與核β-catenin和EZH2水平顯著相關(guān)。接下來，作者評(píng)估了這些樣本中核β-catenin、USP1和EZH2的表達(dá)水平是否與神經(jīng)膠質(zhì)瘤惡性程度相關(guān)。結(jié)果顯示，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中核β-catenin、USP1和EZH2的表達(dá)水平明顯高于低級(jí)星形細(xì)胞瘤。從TCGA數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)來看，較高的USP1 mRNA表達(dá)水平往往預(yù)示著神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者的生存結(jié)果較差。

?研究結(jié)論：β-catenin–USP1–EZH2信號(hào)軸在人類神經(jīng)膠質(zhì)瘤中起重要調(diào)控作用。

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結(jié)論與討論

????????作者發(fā)現(xiàn)，在腫瘤發(fā)生過程中，β-catenin信號(hào)途徑在穩(wěn)定EZH2并控制EZH2介導(dǎo)的基因表達(dá)方面發(fā)揮關(guān)鍵作用。進(jìn)一步的研究表明,β-catenin-USP1-EZH2調(diào)控軸能夠協(xié)同參與神經(jīng)膠質(zhì)瘤形成, β-catenin信號(hào)失調(diào)與EZH2介導(dǎo)的基因沉默是導(dǎo)致腫瘤形成的重要原因，這揭示了神經(jīng)膠質(zhì)瘤腫瘤發(fā)生的關(guān)鍵機(jī)制。因此，靶向β-catenin-USP1-EZH2信號(hào)軸可能為膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的治療提供新的策略。

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Thank you!

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原文鏈接：

https://aacrjournals.org/cancerres/article/79/1/72/633168/Aberrant-Activation-of-Catenin-Signaling-Drives