標(biāo)題：Integrated multi-omics characterization of KRAS mutant colorectal cancer.

期刊：Theranostics（IF =11.556）

時(shí)間：2022.12

背景

結(jié)直腸癌（CRC）是全球第四大致命惡性腫瘤，在新病例方面排名第三，是全球癌癥相關(guān)死亡的第二大原因。被廣泛認(rèn)為是一種異質(zhì)性疾病，其發(fā)病機(jī)制涉及多種基因改變和多種途徑。KRAS突變是結(jié)直腸癌（CRC）中最常見(jiàn)的致癌畸變。一旦KRAS突變發(fā)生，KRAS中的GTP-GDP循環(huán)會(huì)被破壞導(dǎo)致突變KRAS蛋白以活性狀態(tài)積累從而激活下游MAPK和PI3K信號(hào)聯(lián)級(jí)，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖和存活。現(xiàn)已知致癌KRAS突變介導(dǎo)腫瘤微環(huán)境（TME），特別是通過(guò)促進(jìn)炎癥和抑制免疫反應(yīng)最終導(dǎo)致免疫逃避和腫瘤進(jìn)展。然而，TME中細(xì)胞異質(zhì)性的景觀尚未在具有KRAS突變的CRC中得到很好的表征，仍有待研究。以前對(duì)KRAS突變癌癥的大規(guī)模組學(xué)研究極大地促進(jìn)了對(duì)KRAS驅(qū)動(dòng)癌癥分子多樣性的理解。到目前為止，主要還是基于基因組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)。最近的研究表明了蛋白質(zhì)組學(xué)和磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)表征在促進(jìn)腫瘤異質(zhì)性理解方面的重要性。除了加強(qiáng)或補(bǔ)充轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)外，蛋白質(zhì)基因組學(xué)數(shù)據(jù)的整合還可以糾正基于轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)的不準(zhǔn)確推斷，從而得到意想不到的發(fā)現(xiàn)和治療機(jī)會(huì)。

文章重點(diǎn)

整合多組學(xué)（基因組、轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組、磷酸組等）數(shù)據(jù)，全面表征KRAS突變型CRC分子網(wǎng)絡(luò)和生物異質(zhì)性，細(xì)化KRAS突變型CRC的分子分層，有助于開(kāi)發(fā)更適合KRAS突變型（KRAS-Mut）CRC的聯(lián)合療法。報(bào)道了KRAS突變的CRC腫瘤可以分為兩種不同的分子亞型，研究基于整合的轉(zhuǎn)錄組，蛋白質(zhì)組學(xué)和磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)分析，而不是基于突變的殘基。兩種亞型的特征在于不同的臨床特征、生物學(xué)途徑、拷貝數(shù)改變和與KRAS信號(hào)激活相關(guān)的磷酸化級(jí)聯(lián)反應(yīng)。激酶網(wǎng)絡(luò)分析和藥物敏感性預(yù)測(cè)也揭示了可能有助于治療特定亞型的潛在治療藥物?？傮w而言，這些蛋白質(zhì)基因組學(xué)分析為KRAS突變CRC腫瘤的生物學(xué)發(fā)現(xiàn)和治療開(kāi)發(fā)提供了新的途徑。

研究?jī)?nèi)容

1.KRAS突變體與KRAS野生型結(jié)直腸癌的分子比較

作者總結(jié)了KRAS激活信號(hào)通路和每個(gè)節(jié)點(diǎn)的相關(guān)抑制因子（圖1A）?？芍狵RAS發(fā)生突變，KRAS中的GTP-GDP循環(huán)會(huì)被破壞導(dǎo)致突變KRAS蛋白以活性狀態(tài)積累從而激活下游MAPK和PI3K信號(hào)聯(lián)級(jí)，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞增殖和存活。對(duì)CRC患者的預(yù)后生存分析顯示，KRAS-Mut患者的預(yù)后較差（圖1B），在校正了年齡、性別、臨床分期和MSI狀態(tài)后，在多種變量回歸模型中，這種相關(guān)性仍然顯著（圖1C）。GSEA分析表明，KRAS-Mut患者的致癌信號(hào)通路富集程度更高，KRAS野生型（KRAS-WT）患者的趨化因子受體結(jié)合趨化因子的富集程度更高（圖1D）。接下來(lái)，基于轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)，對(duì)KRAS-Mut和KRAS-WT CRC的整體差異調(diào)控進(jìn)行了比較。其中KRAS-Mut組腫瘤遷移和PI3K/AKT激活顯著上調(diào)，而KRAS-WT組免疫調(diào)節(jié)和細(xì)胞代謝顯著上調(diào)（圖1E）?；诨蚪M學(xué)，體細(xì)胞拷貝數(shù)變異（SCNAs）和非整倍性打分分析表明，KRAS-Mut組均表現(xiàn)出較低水平的改變（圖1F，G）。KRAS突變與CRC中25個(gè)最常見(jiàn)的突變基因之間的關(guān)系如圖1H所示，CRC中RID1A和ACVR2A突變與KRAS突變相互排斥，進(jìn)一步提示CRC中存在遺傳畸變。

02.KRAS-Mut結(jié)直腸癌的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組景觀

基于bulk RNA-seq數(shù)據(jù)使用xCell算法分析轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)來(lái)研究基質(zhì)細(xì)胞和免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)水平和CRC中細(xì)胞亞群的變化。大部分細(xì)胞亞群在KRAS-Mut和KRAS-WT腫瘤之間存在顯著差異。KRAS-Mut的上皮細(xì)胞和Treg細(xì)胞較多而KRAS-WT的CD4+?細(xì)胞，巨噬細(xì)胞和pDCs較多（圖2A）。從16個(gè)KRAS-WT和13個(gè)KRAS-Mut的CRC中共獲得55539個(gè)單細(xì)胞鑒定出6種主要細(xì)胞類型（圖2B）。其中T細(xì)胞，B細(xì)胞，髓樣細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞在KRAS-Mut和KRAS-WT中的分布存在顯著差異。對(duì)這4類細(xì)胞進(jìn)一步聚類分別鑒定到8個(gè)，5個(gè)，8個(gè)和11個(gè)細(xì)胞亞群。KRAS-WT中CD4+ T細(xì)胞，CD8+ T細(xì)胞和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞亞群的分布較多，而KRAS-Mut中IgG+漿細(xì)胞，SPP1+巨噬細(xì)胞和肌成纖維細(xì)胞亞群的分別較多（圖2C和2D）。

03.鑒定KRAS-Mut亞群的分子亞型

進(jìn)一步整合了來(lái)自CPTAC數(shù)據(jù)集的公開(kāi)轉(zhuǎn)錄組，蛋白質(zhì)組學(xué)和磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)，以研究KRAS-Mut腫瘤的共識(shí)分子亞型和治療脆弱性。KRAS-Mut CRC被分為兩個(gè)亞型KM1和KM2（圖3A，B）。同時(shí)作者也分別在三個(gè)組學(xué)的數(shù)據(jù)集進(jìn)行了無(wú)監(jiān)督聚類分析，結(jié)果顯示整合三種組學(xué)數(shù)據(jù)可以更準(zhǔn)確地對(duì)KRAS-Mut CRC進(jìn)行分類（圖3C）。為了識(shí)別KM1和KM2亞型之間最具鑒別性的分子特征，使用隨機(jī)森林方法分別在mRNA、蛋白和磷酸化蛋白水平上篩選出5個(gè)mRNA、10個(gè)蛋白和19個(gè)磷酸化蛋白作為分型特征因子（圖3D）。作者進(jìn)一步比較了KRAS中的突變殘基，KM1和KM2亞組之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖3E，F(xiàn)）。KM1與KM2亞組相比，患者有更好預(yù)后（圖3G，H）。

04.KRAS-Mut?結(jié)直腸癌的腫瘤基因組變異

作者進(jìn)一步分析了KRAS-Mut CRC患者的基因組景觀。對(duì)CPTAC和TCGA隊(duì)列進(jìn)行SMG分析。結(jié)果顯示ARID1A和BRAF在KRAS-WT組中的突變率高于KRAS-Mut組（圖4A）。TCGA隊(duì)列中，KRAS-Mut的APC和PCBP1突變頻率高于KRAS-WT。CRC腫瘤中KM1、KM2和KRAS-WT中單核苷酸變異存在差異（圖4B），提示在KRAS突變的異質(zhì)性中存在特定的突變過(guò)程。隨后，作者從基因組數(shù)據(jù)中提取了5個(gè)突變特征（圖4C），突變計(jì)數(shù)和CNA的基因組改變?cè)贙M1、KM2和KRAS-WT亞型腫瘤中具有顯著差異（圖4D，E）。

05.具有特定臨床特征和分子過(guò)程的KRAS突變模式

作者進(jìn)一步探討CRC腫瘤中KRAS突變模式與臨床特征和分子亞型的關(guān)系。KRAS突變亞型的前50個(gè)差異表達(dá)mRNA轉(zhuǎn)錄本，蛋白質(zhì)和磷酸蛋白顯示在熱圖中。發(fā)現(xiàn)所有的MSI陽(yáng)性腫瘤都聚集在KRAS-WT亞組中，并導(dǎo)致了高突變表型、MSI和免疫相關(guān)的CMS1轉(zhuǎn)錄組亞型的聚集和BRAF、ARID1A突變。KM2與腫瘤晚期、間充質(zhì)表型、CMS4轉(zhuǎn)錄組亞、ProS-C蛋白質(zhì)組亞型和免疫亞型2相關(guān)，提示間質(zhì)浸潤(rùn)、血管生成和預(yù)后較差。KM1亞型主要表現(xiàn)為腫瘤早期、CIN表型、上皮細(xì)胞和代謝相關(guān)的CMS3轉(zhuǎn)錄組亞型、ProS-E蛋白質(zhì)組亞型和免疫亞型1（圖5A，B）。TCGA隊(duì)列的結(jié)果與之一致（圖5C）。腫瘤生物學(xué)特征分析表明，在CPTAC隊(duì)列中，KM2亞型的巨噬細(xì)胞，MDSCs，缺氧特征，EMT特征和基質(zhì)打分最高（圖5D）。xCELL算法分析表明KM2亞型的MSCs，脂肪細(xì)胞和M2巨噬細(xì)胞等較多而KM1亞型的記憶B細(xì)胞和NK細(xì)胞較多（圖5E）。亞型間富集的生物過(guò)程和免疫浸潤(rùn)也具有顯著差異（圖5D，E）。

06.通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)和磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)分析對(duì)KRAS突變模式進(jìn)行功能注釋

作者對(duì)KM1和KM2腫瘤亞型在RNA，蛋白質(zhì)和磷蛋白水平上進(jìn)行了功能富集差異分析，以進(jìn)一步闡明KRAS突變亞型的生物學(xué)意義。對(duì)KM1和KM2亞型進(jìn)行ssGSEA分析。KM1亞型中過(guò)氧化物酶體，MYC靶點(diǎn)和Wntβ-catenin通路顯著富集，KM2亞型中EMT，凝血，血管生成和肌生成顯著富集（圖6A）。磷蛋白數(shù)據(jù)集的PTM分析表明，KM2亞型的特征是PKACA，VEGF，PI3K的激酶活性上調(diào)，KM1亞型的特征是MEK，PI3K/mTOR和紫杉醇藥物靶點(diǎn)上調(diào)。此外，EMT過(guò)程和血管生成通路的代表蛋白在KM2亞型中顯著過(guò)表達(dá)（圖6B），而RBM15和HNRNPM在KM1亞型中顯著過(guò)表達(dá)（圖6B）。磷酸化位點(diǎn)表達(dá)水平分析表明，KM2亞型中粘附信號(hào)相關(guān)磷酸化位點(diǎn)FLNA-S1630和MYO1F-S1023和間質(zhì)表型相關(guān)位點(diǎn)VIM-S5,COL1A1-S176和TFB1I1-S143的磷酸化水平顯著上調(diào)，而KM1亞型中酪氨酸蛋白激酶受體EPHB2-S776和細(xì)胞周期相關(guān)蛋白CDK11A-S577和CDK13-S432的水平顯著上調(diào)（圖6C）。富集分析表明，肌動(dòng)蛋白絲狀過(guò)程，局灶粘附和Rho GTPases信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等功能顯著富集（圖6D）。KM1亞型中，CDC樣激酶CLK1/2，細(xì)胞周期蛋白依賴激酶CDK1/7和細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶MAP1/3顯著富集，而KM2亞型中凋亡相關(guān)激酶PAK2, PAK5和AKT絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶顯著增加（圖6E）。

07.分子特征與藥物敏感性之間的相關(guān)性分析揭示了KRAS-Mut結(jié)直腸癌的亞群特異性療法

最后作者進(jìn)一步探討了KRAS-Mut亞型在CRC中的潛在脆弱性，使用DepMap數(shù)據(jù)集比較基于大規(guī)模RNAi篩選的結(jié)直腸癌細(xì)胞系的基因依賴性。41個(gè)KRAS突變的CRC細(xì)胞系被篩選并分類為KM1或KM2亞群。根據(jù)小于-0.3的平均依賴性評(píng)分作為閾值鑒定到13個(gè)依賴評(píng)分顯著不同的基因（圖7A，B）。其中，KM2亞型包括PI3K/AKT信號(hào)相關(guān)的ZFP36L1和VEGF信號(hào)相關(guān)的COL5A1和TLN1；KM1亞型具有細(xì)胞周期/有絲分裂依賴的CCNB3、RAD21和核心Wnt信號(hào)分子CTNNB1。為了進(jìn)一步鑒定KRAS-Mut CRC亞型的亞群特異性治療藥物，作者在三個(gè)藥物反應(yīng)數(shù)據(jù)庫(kù)中來(lái)研究KM1和KM2細(xì)胞亞群的潛在的治療藥物（圖7C，D）。最后，作者畫了一張總結(jié)圖來(lái)展示KRAS-Mut亞型信號(hào)通路，以概述在KRAS-Mut CRC中的發(fā)現(xiàn)（圖7E）。

圖7 KRAS突變型的分子特征和藥物敏感性分析

總結(jié)

通過(guò)單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組對(duì)腫瘤微環(huán)境的深入分析，揭示了KRAS突變型CRC腫瘤的細(xì)胞景觀，并鑒定了具有KRAS突變的特定細(xì)胞亞群。綜合多組學(xué)分析將KRAS突變腫瘤分為兩種不同的分子亞型，稱為KRAS-M1（KM1）和KRAS-M2（KM2）。兩種亞型在KRAS中的突變殘基分布相似，但在預(yù)后、遺傳改變、微環(huán)境失調(diào)、生物表型和潛在治療方法方面具有不同的特征。蛋白質(zhì)與基因組學(xué)分析顯示，KM2亞型富集了EMT、TGF-β和血管生成途徑，KM2亞型與間充質(zhì)表型（CMS4亞型）相關(guān)，表明基質(zhì)浸潤(rùn)和預(yù)后較差。KM1亞型的特征主要在于細(xì)胞周期，E2F和RNA轉(zhuǎn)錄的激活，并與染色體不穩(wěn)定性（CIN）相關(guān)的ProS-E蛋白質(zhì)組學(xué)亞型相關(guān)，這表明細(xì)胞周期蛋白依賴性特征和更好的生存結(jié)果。此外，基于三個(gè)化合物數(shù)據(jù)庫(kù)的藥物敏感性分析揭示了KM1和KM2腫瘤的亞組特異性藥物。