1、為什么在RNA提取時(shí)，RNA總量會很低？

首先要看在RNA提取中細(xì)胞是否裂解充分。加入Trizol到孔板或者平皿后，要用移液器反復(fù)吹打幾下。如果不確認(rèn)是否裂解充分，我們可以把培養(yǎng)板密封好，放置于顯微鏡下，觀察是否還有細(xì)胞，正常情況下細(xì)胞都脫落、裂解，視野中沒有完整的細(xì)胞形態(tài)。

②，要確保有足夠的細(xì)胞量，正常情況下12孔板一個(gè)孔作為一個(gè)樣本，如果熟練24孔板的一個(gè)孔細(xì)胞量是足夠做實(shí)驗(yàn)的，如果細(xì)胞體積大，或者RNA量上不去，就用6孔板來做，或者用平皿。

③，在提取RNA加入的試劑的比例要對，以Trizol為例，1ml的Trizol對應(yīng)試用的是200微升的氯仿和500微升的異丙醇，如果要減少Trizol的用量就相應(yīng)的按照比例減少后面試劑的使用量。

④，異丙醇加入后會分層，需要輕搖混勻。RNA溶液中異丙醇的濃度上不去是不會出現(xiàn)RNA沉淀的，所以加入異丙醇后要搖勻溶液。

⑤，RNA出現(xiàn)沉淀后，要用乙醇洗滌沉淀兩次，這時(shí)沉淀是清晰可見的，我們要用記號筆標(biāo)記一下沉淀的位置。因?yàn)樵诔恋砹栏珊髸兊猛该鳎尤隓EPC水的時(shí)候很可能溶解不到沉淀的位置。

最后，用DEPC水溶解時(shí)，最好先加入10微升，溶解后檢測一下濃度再稀釋，如果RNA太稀就沒有辦法做后續(xù)的實(shí)驗(yàn)了。

2、QPCR結(jié)果為什么沒有差異？

這可能是實(shí)驗(yàn)操作出現(xiàn)了問題。

很多人會存在一個(gè)誤區(qū)，認(rèn)為逆轉(zhuǎn)錄時(shí)加入體系的RNA總量越多越好。

以漢恒生物cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒為例，在配逆轉(zhuǎn)錄體系時(shí)，RNA模板的總量應(yīng)控制在10pg-1μg之間，超出這個(gè)范圍反而會導(dǎo)致結(jié)果異常。

3、如何判斷引物設(shè)計(jì)是否有問題？

如果引物能擴(kuò)增目的片段，擴(kuò)增曲線呈現(xiàn)S型，如果呈指數(shù)增長型，可能是cDNA濃度過低，可適當(dāng)增加cDNA濃度。

溶解曲線應(yīng)該只有一個(gè)峰值，而且峰值的位置是在Tm附近，距離Tm較遠(yuǎn)，或存在多個(gè)峰值則需要重新設(shè)計(jì)引物。

如果懷疑儀器傳感器問題，可以將QPCR產(chǎn)物做瓊脂電泳。

如果引物能擴(kuò)增片段，會在80-250bp附近出現(xiàn)一個(gè)條帶。

4、如何驗(yàn)證提取的RNA是否合格？

一般使用紫外分光光度法，根據(jù)OD260和OD280以及OD260和OD230的比值來判斷

當(dāng)OD260/OD280在1.8-2.0之間時(shí)，說明RNA的純度合格，可用于后續(xù)試驗(yàn)。

OD260/OD280＜1.8 ，說明可能有蛋白質(zhì)或者酚類物質(zhì)的污染。

如在230nm處有吸收峰，說明RNA提取中引入了有機(jī)化合物和鹽離子的污染，理想狀態(tài)下OD260/OD230應(yīng)當(dāng)在2左右，如有污染比值會小于2。

此外還可以用電泳法檢測RNA完整性。