腎細胞癌（RCC）是泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率逐年遞增，且超過1/4的患者出現(xiàn)復發(fā)或轉(zhuǎn)移。前人研究表明，與健康組織相比，RCC的脂質(zhì)代謝譜發(fā)生顯著擾動，但其內(nèi)在分子機制尚不清楚。作為代謝重編程的重要特征之一，脂質(zhì)的從頭合成對癌細胞增殖以及疾病不良預后方面具有顯著影響。TRIM21是具有E3泛素連接酶活性的TRIM家族成員之一，已報道過可通過泛素化并降解非小細胞肺癌中的磷酸果糖激酶來抑制糖酵解，并且在腎細胞癌（RCC）等腫瘤組織內(nèi)低表達，但其如何具體影響RCC腫瘤細胞脂質(zhì)代謝，導致其不良預后的內(nèi)在分子機制尚不清楚。

近日，徐州醫(yī)科大學白津教授課題組在Journal Of Experimental & Clinical Cancer Research上發(fā)表“TRIM21 attenuates renal carcinoma lipogenesis and malignancy by regulating SREBF1 protein stability”的研究文章，作者利用脂質(zhì)組學和其它多種分子生物學方法揭示了TRIM21抑制RCC脂質(zhì)代謝過程的新途徑，并揭示了RCC靶向代謝治療和預后診斷的發(fā)展。中科新生命參與了該研究中脂質(zhì)組學檢測的相關工作。

?研究材料

RCC患者的癌和癌旁組織，小鼠模型、RCC細胞系

?技術路線

步驟1：敲低/過表達TRIM21后觀察腫瘤細胞的脂質(zhì)代謝變化；

步驟2：脂質(zhì)組學分析TRIM21過表達對不同脂質(zhì)亞類含量的調(diào)節(jié)；

步驟3：基于轉(zhuǎn)錄、蛋白和修飾三個維度分析TRIM21通過SREBF1調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝的機制；

步驟4：驗證SREBF1對于TRIM21介導的脂質(zhì)代謝的重要作用；

步驟5：分析TRIM21與SREBF1表達水平與RCC患者預后的相關性。

?研究結果

1. 沉默TRIM21可降低RCC細胞對脂肪酸的依賴性

考慮到RCC細胞內(nèi)的脂質(zhì)異常積累，作者使用脂肪酸（FA）氧化應激檢測試劑盒來評估TRIM21在細胞模型中敲低時對FA的依賴性。在該實驗中，使用能夠抑制肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶1a（CPT1a）活性進而抑制FA氧化的小分子抑制劑Etomoxir作為陽性對照。結果表明，當TRIM21在細胞系中被敲低后，Etomoxir干預對最大呼吸能力幾乎沒有影響，證明TRIM21缺乏減輕了RCC細胞對FA的依賴性。

2. 沉默TRIM21可增強RCC細胞中的脂質(zhì)積累

上述結果表明當細胞內(nèi)缺乏TRIM21時，F(xiàn)A不被線粒體消耗，因此其去向引起了作者的關注。脂滴（LDs）是保守的動態(tài)細胞器，可以儲存和動員FAs和其它脂質(zhì)分子，之前的研究也已經(jīng)證明了RCC細胞的特征之一即為LDs堆積。采用油紅O染色法和尼羅紅染色法研究RCC細胞中LDs的含量，發(fā)現(xiàn)當敲低TRIM21后LD含量顯著增加，而過表達TRIM21則降低LD含量。

3. ?TRIM21過表達降低RCC細胞中的脂質(zhì)含量

為了進一步闡明TRIM21減少脂質(zhì)含量的生物學現(xiàn)象，作者對TRIM21過表達組和對照組的RCC細胞進行了非靶脂質(zhì)組學分析。組學結果首先證明了兩組間存在顯著的脂質(zhì)分子表達差異，亞類差異分析表明TG、DG、ChE在TRIM21過表達細胞中的含量顯著下降。這些結果進一步驗證了TRIM21減少RCC細胞脂質(zhì)積累的能力。

4. TRIM21基于對SREBF1泛素化修飾降低其蛋白水平降低脂酶表達

進一步通過qPCR和WB實驗探索TRIM21調(diào)控脂質(zhì)含量的機制，發(fā)現(xiàn)，當TRIM21被敲低或過表達時，參與脂質(zhì)合成和分解的一些關鍵代謝酶的mRNA和蛋白質(zhì)水平發(fā)生變化。其中SREBF1在轉(zhuǎn)錄水平未發(fā)生變化，而在蛋白質(zhì)水平受TRIM21的顯著調(diào)控，意味著TRIM21可能通過調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)穩(wěn)定性來降低SREBF1的蛋白質(zhì)含量，并且TRIM21可能以SREBF1依賴性方式抑制脂質(zhì)代謝。

為了證明上述論點，作者首先通過免疫沉淀法（IP）證明了TRIM21與SREBF1存在互作；其次繼續(xù)確定了TRIM21過表達能夠增加SREBF1的泛素化修飾水平；接著基于TRIM21的不同截短蛋白證明了SPRY結構域主要是TRIM21與SREBF1相互作用所必需的；最后IP分析進一步證實，由TRIM1誘導的SREBF21泛素化主要通過K63鏈發(fā)生。以上實驗證明了TRIM21主要通過SPRY結構域與SREBF1互作，將K63-泛素遞送至SREBF1，致蛋白酶體對SREBF1的識別和降解，能進一步減弱RCC細胞的脂質(zhì)生成。

5. SREBF1對TRIM21介導的脂質(zhì)代謝抑制至關重要

上述結果雖闡明了TRIM21調(diào)控SREBF1蛋白水平變化的分子機制，然而TRIM21調(diào)控RCC細胞脂質(zhì)的產(chǎn)生是否取決于SREBF1表達量的這一問題仍不得而知。作者在同時敲低/過表達SREBF1和TRIM21后，通過細胞熒光強度和吸光度法檢測細胞中脂滴的含量。結果表明，SREBF1敲低逆轉(zhuǎn)了TRIM21敲低引起的脂滴含量增加，并且SREBF1過表達也逆轉(zhuǎn)了TRIM21過表達誘導的脂滴含量降低的現(xiàn)象。這些結果表明，TRIM21對RCC細胞脂質(zhì)代謝的調(diào)節(jié)作用主要依賴于SREBF1。

6. ?動物模型驗證TRIM21抑制脂質(zhì)積累的機制

使用小鼠模型檢測熒光表達并用油紅O染色以檢測脂滴含量。結果與細胞模型數(shù)據(jù)一致：與對照組相比，TRIM21過表達組腫瘤生長速度降低且油紅O染色減少；SREBF1過表達組腫瘤生長速度加快且油紅O染色增加；TRIM21+SREBF1過表達組的腫瘤生長速度及油紅O染色同對照組相當。這些結果進一步證明了TRIM21在體內(nèi)可以通過調(diào)節(jié)SREBF1的表達來抑制脂質(zhì)代謝。

7. ?TRIM21-SREBF1可作為RCC的預后生物標志物

TCGA數(shù)據(jù)庫的分析結果表明，低TRIM21表達伴隨著高SREBF1表達，代表高危人群。TRIM21-SREBF1表達對于患者的10年生存期的預測AUC為0.725，表明TRIM21和SREBF1可能是RCC預后的可靠生物標志物。

作者同樣檢測了239名RCC患者癌組織中TRIM21和SREBF1的表達水平，并進一步檢查了它們的相關性和臨床意義。發(fā)現(xiàn)，低TRIM21表達與腫瘤大小、淋巴結轉(zhuǎn)移和遠處轉(zhuǎn)移呈顯著正相關，高SREBF1表達與腫瘤大小、淋巴結轉(zhuǎn)移和遠處轉(zhuǎn)移呈顯著負相關。此外，SREBF1與TRIM21在癌組織中的表達呈負相關，低TRIM21和高SREBF1水平的患者表現(xiàn)出最差的OS。這些資料表明，這兩種分子的聯(lián)合檢測可能在RCC中具有可靠的預后價值。

小結

該研究證明了TRIM21通過降低SREBF1穩(wěn)定性在調(diào)節(jié)RCC脂質(zhì)代謝中起關鍵作用，為TRIM21的功能提供了新的見解，并建議TRIM21作為RCC患者的治療靶點。

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