一、概念

? ? 免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation，Co-IP)是研究蛋白質(zhì)——蛋白質(zhì)相互作用的常用技術(shù)。

? ? 通常用于測(cè)定兩種已知蛋白質(zhì)能否在細(xì)胞內(nèi)結(jié)合并產(chǎn)生相互作用，以及用于確定與某種特定蛋白質(zhì)具有相互作用的未知蛋白質(zhì)。

該法的優(yōu)點(diǎn)：

? ? 蛋白質(zhì)處于天然狀態(tài)，蛋白質(zhì)的相互作用可以在天然狀態(tài)下進(jìn)行，可以分離得到天然狀態(tài)下相互作用的蛋白質(zhì)復(fù)合體。

【附：以抗體和抗原之間的專(zhuān)一性作用為基礎(chǔ)的用于研究蛋白質(zhì)相互作用的經(jīng)典方法，是確定兩種蛋白質(zhì)在完整細(xì)胞內(nèi)生理性相互作用的有效方法。（簡(jiǎn)易概念）】

詳細(xì)概念：

? ? 免疫共沉淀就是利用——抗原（X）與蛋白（Y)先結(jié)合，再通過(guò)X的抗體沉淀X，隨后利用精制的prorein預(yù)先結(jié)合到磁珠上，使得它能與抗原的溶液及其抗體反應(yīng)后磁珠上的prorein就能吸附抗原，獲得復(fù)合體（X+Y)，然后就可以對(duì)Y（蛋白）進(jìn)行檢測(cè)，從而獲得蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用的信息。

二、注意事項(xiàng)：

1. 抗原沒(méi)有免疫沉淀下來(lái)：

①樣品中抗原含量太少，不足以能被檢測(cè)，通過(guò)WB驗(yàn)證裂解液中蛋白的表達(dá)及裂解效率；如果需要，請(qǐng)加大樣品量

②抗體無(wú)法結(jié)合抗原，使用新生產(chǎn)的特異性抗體，或者選擇另一種識(shí)別不同抗原表位的抗體

③modified RIPA Buffer（改良的RIPA緩沖液）中的成分干擾抗體抗原的結(jié)合，嘗試更換其他裂解液。

2. 洗脫下的抗體條帶掩蓋了目標(biāo)抗原：

抗原的分子量大約是50kDa或25kDa，WB實(shí)驗(yàn)選擇使用與免疫共沉淀體不同種屬的抗體。

3. 獲得蛋白量低：

①蛋白降解，加入蛋白酶抑制劑。

②所用beads量不夠，加大免疫復(fù)合物使用的beads量。

③樣品中目標(biāo)蛋白量不夠，提高樣品量。

④ 多條非特異性條帶：

有非特異性的蛋白結(jié)合在beads上，可以嘗試提高modified RIPA Buffer（改良的RIPA緩沖液）中NaCl濃度。

5. beads聚集：未按步驟預(yù)洗beads

三、實(shí)驗(yàn)關(guān)鍵：

1、實(shí)驗(yàn)最中最需要注意的是抗體的性質(zhì)，特別是多抗的特異性

2、要考慮到抗體和緩沖液的比例，抗體過(guò)少就會(huì)不能檢出抗原，緩沖液太少則會(huì)容易出現(xiàn)假陽(yáng)性，緩沖液過(guò)多會(huì)出現(xiàn)抗原被稀釋現(xiàn)象

3、確定蛋白間的相互作用發(fā)生在細(xì)胞中，不是由于細(xì)胞的容易才發(fā)生的，這需要進(jìn)行蛋白質(zhì)的定位來(lái)確定

4、 為防止蛋白降解、修飾改變、溶解抗原，緩沖液必須加蛋白酶抑制劑，在低溫下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)