期刊：Stem Cell Research & Therapy

影響因子：8.079

發(fā)表年月：2022年7月

材料：新西蘭大白兔IUA經(jīng)hUCB-MSCs移植治療后的樣本（n=1）

方法：10x Genomics高通量單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序

研究目的

子宮內(nèi)膜是播種生命的“土壤”。然而，子宮內(nèi)膜損傷和宮腔粘連會讓這片“土壤”變得貧瘠，從而導(dǎo)致不孕癥。宮腔粘連（Intrauterine Adhesions，IUA）又稱Asheman綜合征，是由于各種原因?qū)е碌淖訉m內(nèi)膜損傷，引起宮腔纖維化粘連，使宮腔部分或全部閉塞。目前，IUA治療的金標(biāo)準(zhǔn)是宮腔鏡下切除粘連，術(shù)后輔以雌激素治療以刺激子宮內(nèi)膜的再生。這種治療策略對輕度或中度疾病患者有效，但對嚴(yán)重IUA患者效果不佳。

近年來，干細(xì)胞治療對緩解子宮內(nèi)膜功能障礙性疾病具有很好的應(yīng)用前景。宮腔粘連患者經(jīng)過粘連松解手術(shù)后，將植入臨床級臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（ MSCs ）的可降解膠原支架移植到宮腔內(nèi)，MSCs有助于促進(jìn)子宮內(nèi)膜修復(fù)和受損組織再生。雖然MSCs在IUA治療中是一種很有前途的細(xì)胞治療方法，但這些研究仍處于實驗研究階段，其確切的治療機(jī)制值得進(jìn)一步研究。

為了探究hUCB-MSCs治療IUA的優(yōu)勢，作者利用兔作為實驗動物，通過機(jī)械損傷及感染方法建立IUA模型，隨后分別進(jìn)行雌激素和hUCB-MSCs移植治療。與雌激素治療組相比，hUCB-MSCs治療組術(shù)后恢復(fù)程度更接近于正常組。作者為探討其潛在的治療機(jī)制，首次利用scRNA-seq對 IUA模型hUCB-MSCs治療后子宮內(nèi)膜樣本進(jìn)行分析，研究發(fā)現(xiàn)hUCB-MSCs注射后可以分化為子宮內(nèi)膜細(xì)胞，這將有助于了解間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療子宮內(nèi)膜損傷的機(jī)制和臨床治療。

研究結(jié)果

Result1? hUCB?MSCs鑒定及其特征描述

首先對人間充質(zhì)干細(xì)胞（hUCB-MSCs）進(jìn)行鏡檢，可以看到細(xì)胞貼壁且呈成纖維細(xì)胞樣形狀。

經(jīng)過初步質(zhì)量控制，最終保留59913個細(xì)胞，其中有30968個細(xì)胞來自正常宮頸，有10944個細(xì)胞來自正HSIL，有11660個細(xì)胞來自正宮頸，剩余6341個細(xì)胞來淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶。隨后利用t-SNE降維聚類，根據(jù)細(xì)胞基因表達(dá)值將其化為9個不同的簇（T/NK細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞、B細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞）。

hUCB-MSCs 細(xì)胞呈CD73、CD90、CD105陽性，以及CD34、CD45、CD11b、CD19和HLA-DR陰性。流式結(jié)果顯示，這些結(jié)果符合人間充質(zhì)干細(xì)胞（hUCB-MSCs）的特征。

Result2? hUCB-MSCs移植后子宮內(nèi)膜腺體數(shù)量和纖維化率

利用兔作為實驗動物，使用機(jī)械損傷子宮內(nèi)膜直至粗糙感，術(shù)后放置脂多糖棉線，建立IUA模型。

IUA造模后處理：一組為雌激素（estradiol benzoate）注射治療組，另一組為hUCB-MSCs注射治療組。

根據(jù)HE染色和Masson染色結(jié)果，正常子宮內(nèi)膜表面由高柱狀上皮細(xì)胞組成，子宮內(nèi)膜腺體主要位于粘膜下層和基底層。與正常組相比，造模組（14/28天）腺體數(shù)量明顯減少，纖維化率明顯升高。與術(shù)后14天相比，術(shù)后第28天的情況沒有改善，這表明兔IUA模型成功建立。與IUA造模術(shù)后28天相比，hUCB-MSCs治療后子宮內(nèi)膜腺體數(shù)量顯著增加，纖維化率顯著下降。雌激素治療組與IUA模型組術(shù)后28天相比，可以觀察到存在子宮內(nèi)膜腺數(shù)量增加和纖維化率下降的趨勢，但無顯著性差異。與雌激素治療組相比，hUCB-MSCs治療組的兩項指標(biāo)更接近于對照組，這表明hUCB-MSCs在IUA治療中的明顯優(yōu)勢。

Result3? hUCB-MSCs治療后子宮內(nèi)膜ER、Ki-67和TGF-β1的表達(dá)

為了探討hUCB-MSCs對IUA子宮內(nèi)膜的作用，作者進(jìn)一步檢測了ER、Ki-67和TGF-β1在子宮內(nèi)膜組織中的表達(dá)，分別反映激素水平、血管生成能力和子宮組織纖維化程度。hUCB-MSCs治療后，與造模后28天相比，ER和Ki-67表達(dá)明顯增加，TGF-β1表達(dá)明顯減少。值得注意的是，與造模術(shù)后28天相比，雌激素治療組的ER表達(dá)增加，TGF-β1表達(dá)減少，而Ki-67表達(dá)無顯著差異。此外，與雌激素治療組相比，hUCB-MSCs治療組中ER、Ki-67和TGF-β1的表達(dá)更接近于對照組。因此，hUCB-MSCs在IUA治療中優(yōu)于雌激素。

Result4? ScRNA-seq顯示hUCB-MSCs可以分化為子宮內(nèi)膜細(xì)胞

作者為了從單細(xì)胞水平上研究IUA的細(xì)胞組成結(jié)構(gòu)以及細(xì)胞分化軌跡，利用hUCB-MSCs移植治療后的兔IUA子宮內(nèi)膜樣本進(jìn)行scRNA-seq以及后續(xù)生物信息學(xué)分析。

考慮到利用hUCB-MSC治療家兔IUA樣本，作者將測序的結(jié)果分別比對到人和家兔參考基因組中。經(jīng)過質(zhì)控后，作者得到人源性細(xì)胞4097個，經(jīng)過t-SNE降維聚類后共獲得8個細(xì)胞簇。根據(jù)細(xì)胞基因表達(dá)以及基因功能富集分析，鑒定了四種主要細(xì)胞類型，包括間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）、成纖維細(xì)胞（Fibroblasts）、上皮細(xì)胞（Epithelial cells）和巨噬細(xì)胞（Macrophages）。MSCs是hUCB-MSCs注射治療后的殘余細(xì)胞，其余三種細(xì)胞類型（ Fibroblasts 、 Epithelial cells和Macrophages）可能是hUCB-MSCs注射治療后子宮內(nèi)膜重建的結(jié)果，由于hUCB-MSCs表現(xiàn)出干細(xì)胞樣特征，并有可能分化為其他細(xì)胞類型，因此作者推測hUCB-MSCs分化為Fibroblasts 、 Epithelial cells和Macrophages，并重建子宮內(nèi)膜結(jié)構(gòu)。

為了驗證這一猜想，作者利用Monocle進(jìn)行擬時分析，結(jié)果表明， hUCB-MSCs有分化成為Fibroblasts 、 Epithelial cells和Macrophages的趨勢，這種由hUCB-MSCs分化成子宮內(nèi)膜組織的特征，將有助于了解間充質(zhì)干細(xì)胞注射治療子宮內(nèi)膜損傷的機(jī)制以及臨床治療。

同樣作者得到兔源細(xì)胞8792個，經(jīng)過t-SNE降維聚類以及亞群鑒定，共獲得四種主要細(xì)胞類型（內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、上皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞）以及三種罕見的細(xì)胞類型。

將人源細(xì)胞數(shù)據(jù)與兔源細(xì)胞數(shù)據(jù)合并比較，作者觀察到內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的比例升高，而上皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的比例降低。通過與先前研究中正常子宮組織細(xì)胞百分比進(jìn)行比對分析，作者發(fā)現(xiàn)與單獨兔源細(xì)胞類型相比，合并后細(xì)胞類型的分布更類似于正常子宮內(nèi)膜組織細(xì)胞的比例。提示間充質(zhì)干細(xì)胞可以分化為子宮內(nèi)膜組織細(xì)胞，使受損的子宮內(nèi)膜環(huán)境恢復(fù)正常，這反映了間充質(zhì)干細(xì)胞注射在IUA治療中的價值。隨著hUCB-MSCs注射后作用時間的延長和機(jī)體自我修復(fù)的啟動，受損子宮內(nèi)膜組織中的細(xì)胞比例可能越來越趨于正常。

Result5? RNA測序顯示hUCB-MSCs在治療IUA中調(diào)節(jié)Th17/Treg平衡和NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)

為了闡明hUCB-MSCs治療在IUA中的作用機(jī)制，作者對兔IUA模型組（n=3）以及hUCB-MSCs治療組（n=3）樣本進(jìn)行bulk RNA-seq，從而觀察hUCB-MSCs注射治療前后IUA樣本中的分子表達(dá)變化。結(jié)果表明hUCB-MSCs注射治療后導(dǎo)致2188個基因上調(diào)，1193個基因下調(diào)?；谶@些差異表達(dá)的基因進(jìn)行GO和KEGG途徑富集分析。GO結(jié)果表明，差異表達(dá)的基因主要在細(xì)胞增殖和細(xì)胞遷移相關(guān)功能中富集。KEGG分析表明，hUCB-MSCs注射治療可能參與免疫細(xì)胞（T1、T2和T17）分化、T細(xì)胞受體信號通路調(diào)節(jié)和NF-κB信號通路調(diào)節(jié)有關(guān)的途徑。

據(jù)報道，NF-κB信號通路可能參與hUCB-MSCs注射治療IUA，因此作者重點關(guān)注NF-κB的表達(dá)。通過bulk RNA-Seq、qRT-PCR、Western Blot分析證實，與治療前（兔IUA模型組）相比， NF-κB基因與蛋白水平均有所降低，表明NF-κB信號可能在hUCB-MSCs調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜微環(huán)境中發(fā)揮關(guān)鍵作用。文獻(xiàn)研究表明，間充質(zhì)干細(xì)胞可以調(diào)節(jié)Na?ve型T細(xì)胞向Treg型細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，并降低Th17/Treg細(xì)胞的比例以發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功能，上述過程可以通過激活NF-κB信號通路進(jìn)行調(diào)節(jié)。因此，作者認(rèn)為hUCB-MSCs在治療IUA中調(diào)節(jié)了T17/Treg平衡以及參與NF-κB信號傳導(dǎo)，這也促進(jìn)了hUCB-MSCs注射治療IUA的機(jī)制理解和臨床應(yīng)用。

文章總結(jié)

這項研究探討了hUCB-MSCs治療IUA的潛在機(jī)制，作者首次采用scRNA-seq對IUA模型組以及hUCB-MSCs治療組樣本進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)hUCB-MSCs注射后可以分化為子宮內(nèi)膜細(xì)胞（成纖維細(xì)胞、上皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞）。此外作者還發(fā)現(xiàn)，hUCB-MSCs治療IUA過程中可能參與免疫細(xì)胞（T1、T2和T17）分化、T細(xì)胞受體信號調(diào)節(jié)以及NF-κB信號通路平衡等過程，這將有助于了解間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療子宮內(nèi)膜損傷的機(jī)制以及臨床治療。此項研究證明，hUCB-MSCs可能是一種很有前途的IUA治療方法，然而對于IUA患者的長期安全性和有效性還需要更多的研究。

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