簡(jiǎn)介：

CHO細(xì)胞又稱中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞，是一種來(lái)源于中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢的上皮細(xì)胞系。中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢（CHO）細(xì)胞以其獨(dú)特的特性，已成為制備治療性重組蛋白的主要工具。這種細(xì)胞系通常用于生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究。同時(shí)，它也是最廣泛使用的哺乳動(dòng)物宿主在工業(yè)生產(chǎn)治療蛋白方面。

應(yīng)用程序：

基因打靶法構(gòu)建基因敲除CHO細(xì)胞系

由于CHO細(xì)胞系是治療性抗體產(chǎn)生的主要宿主，構(gòu)建高效的CHO細(xì)胞系具有重要意義。在構(gòu)建CHO細(xì)胞系中，常用的轉(zhuǎn)染方法有兩種，一種是隨機(jī)整合法，另一種是基因靶向法。前者導(dǎo)致抗體產(chǎn)生率的變化，通常會(huì)影響轉(zhuǎn)基因表達(dá)水平。

然而，在基因打靶方法中，外源基因被插入特定的染色體區(qū)域。這種方法是基于利用針對(duì)宿主細(xì)胞特定基因組區(qū)域的序列進(jìn)行同源重組。研究人員利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)作為基因靶向方法，通過引導(dǎo)RNA和Cas9誘導(dǎo)雙鏈斷裂，提高同源重組效率。因此，CRISPR/Cas9載體系統(tǒng)可以有效地將外源基因插入CHO細(xì)胞系中。

利用谷氨酰胺合成酶基因敲除細(xì)胞提高CHO細(xì)胞系的產(chǎn)生效率

盡管中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢（CHO）細(xì)胞以其獨(dú)特的特性，已經(jīng)成為制造治療性重組蛋白的主要工具，但如何有效地鑒定這些稀有的CHO細(xì)胞系是CHO細(xì)胞系產(chǎn)生的主要挑戰(zhàn)之一，在大量低產(chǎn)和低產(chǎn)無(wú)性系中的高產(chǎn)無(wú)性系。目前，有兩種主要的CHO表達(dá)系統(tǒng)被廣泛應(yīng)用，基于二氫葉酸還原酶（DHFR）的甲氨蝶呤（MTX）選擇和基于谷氨酰胺合成酶（GS）的甲硫氨酸硫氧胺（MSX）選擇。

為了研究?jī)?nèi)源性GS表達(dá)對(duì)選擇效率的潛在影響，采用鋅指核酸酶（ZFN）技術(shù)，以內(nèi)源性CHO-GS基因?yàn)榘悬c(diǎn)，構(gòu)建了GS基因敲除CHOK1SV細(xì)胞株。雙等位基因修飾CHO-GS基因的高效性（～2%）支持了ZFN技術(shù)的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，特別是在CHO細(xì)胞中。通過對(duì)所有GS基因敲除細(xì)胞系谷氨酰胺依賴性生長(zhǎng)的觀察，證實(shí)了GS酶功能的破壞。

谷氨酰胺合成酶介導(dǎo)的CHO細(xì)胞單克隆抗體篩選

利用GS基因敲除CHO細(xì)胞系12和啟動(dòng)子工程，即使在沒有MSX1的情況下，基于GS的系統(tǒng)也能有效地產(chǎn)生細(xì)胞系。利用兩個(gè)不同的宿主細(xì)胞系（CHO-K1和GS-knockout-CHO，GS-KO），在不同MSX濃度下，通過單輪篩選產(chǎn)生mAb的rCHO細(xì)胞克隆。

GS基因敲除CHO細(xì)胞系具有改進(jìn)的選擇嚴(yán)格性。使用GS基因敲除CHO宿主細(xì)胞系有助于在沒有MSX的情況下快速產(chǎn)生高產(chǎn)克隆，降低乳酸和氨的產(chǎn)量。

mAb克隆產(chǎn)生和長(zhǎng)期培養(yǎng)的生產(chǎn)穩(wěn)定性試驗(yàn)流程示意圖。

mAb克隆產(chǎn)生和長(zhǎng)期培養(yǎng)的生產(chǎn)穩(wěn)定性試驗(yàn)流程示意圖。

CRISPR/Cas9基因敲除HEK293細(xì)胞系的策略

敲除HEK293細(xì)胞株的工作流程

Reference:

Fan L, Kadura I, Krebs LE, Hatfield CC, Shaw MM, Frye CC, Improving the efficiency of CHO cell line generation using glutamine synthetase gene knockout cells.

Aga, M., Yamano, N., Kumamoto, T. et al. Construction of a gene knockout CHO cell line using a simple gene targeting method. BMC Proc 9, P2 (2015).

Noh, S.M., Shin, S. & Lee, G.M. Comprehensive characterization of glutamine synthetase-mediated selection for the establishment of recombinant CHO cells producing monoclonal antibodies. Sci Rep 8, 5361 (2018).

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