對(duì)于許多嚴(yán)重的疾病，例如心力衰竭、晚期糖尿病、血友病、骨髓瘤、末期肝硬化等，目前還未能研發(fā)出完全治愈這些疾病的藥物，最有效的方法是異體移植。但是由于供體有限以及自體免疫排斥反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)，科學(xué)家們苦心專研，嘗試尋找除異體移植外，更高效、安全的治療方法。誘導(dǎo)型多能干細(xì)胞(induced pluripotent stem cells,iPSC)可以來(lái)源于受體本身的體細(xì)胞，排除了免疫排斥反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)，且具有不斷自我更新和多向分化潛能，iPS細(xì)胞來(lái)源的心肌細(xì)胞、肝細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、T細(xì)胞、造血干細(xì)胞和胰島細(xì)胞的移植治療能夠有效解決許多醫(yī)學(xué)難題。?通過(guò)CRISPR/Cas9的方法，將模擬疾病發(fā)生的突變引入iPSC，或修復(fù)iPSC疾病模型中的突變, 再分化得到所需要的細(xì)胞進(jìn)行研究或治療，是目前iPSC研究的大熱門(mén)。

iPSC 的CRISPR基因編輯，為各類疾病研究打開(kāi)新大門(mén)

由于iPSC不像普通腫瘤細(xì)胞系那樣具有總?cè)旧w異常和異常強(qiáng)烈的DNA損傷反應(yīng)的特點(diǎn)，基因編輯在人類iPSC中成功率更低。但是由于CRISPR/Cas9具有效率高、易于構(gòu)建和在人細(xì)胞中的毒性較低等優(yōu)點(diǎn)，在iPSC基因編輯中備受青睞。

CRISPR/Cas9敲除iPSC中RAG2基因，有效生成具有穩(wěn)定抗原特異性的CD8αβ-T細(xì)胞

T細(xì)胞的數(shù)量和增殖困難是T細(xì)胞免疫治療的主要障礙，通過(guò)使用具有“再生”能力的多能干細(xì)胞誘導(dǎo)分化成為具有抗原特異性的T細(xì)胞（T-iPSCs）可以克服這一障礙。嚴(yán)格的抗原特異性對(duì)于安全有效的T細(xì)胞免疫治療是必不可少的，然而，人T-iPSC分化的CD8αβ細(xì)胞在CD4/CD8雙陽(yáng)性分化過(guò)程中，通過(guò)T細(xì)胞受體（TCR）α鏈的重排會(huì)失去抗原特異性。通過(guò)使用CRISPR/Cas9敲除T-iPSCs中重組酶基因（RAG2）阻止了這種額外的TCR重排。含有穩(wěn)定的TCR的CD8αβ-T細(xì)胞在異種移植腫瘤模型能有效地抑制腫瘤生長(zhǎng)。這些方法有助于安全有效的T細(xì)胞免疫治療。
CRISPR-U?可以通過(guò)核轉(zhuǎn)染法高效地將gRNA和Cas9轉(zhuǎn)入iPSC細(xì)胞中，藥篩完成后挑選單克隆培養(yǎng)。選擇不同的克隆分別進(jìn)行靶位點(diǎn)擴(kuò)增及測(cè)序驗(yàn)證，篩選出基因敲除的陽(yáng)性克隆。（Minagawa, Atsutaka, et al.）

病人細(xì)胞構(gòu)建iPSC疾病模型，使用CRISPR/Cas9修復(fù)引起疾病的點(diǎn)突變位點(diǎn)，深入研究點(diǎn)突變的病理性作用

阿爾茨海默?。ˋlzheimer's disease，AD）是一種進(jìn)行性和不可逆轉(zhuǎn)的神經(jīng)退行性疾病，可導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞變性和腦萎縮，被認(rèn)為是最常見(jiàn)的癡呆形式。PSEN1基因A79V突變可引起阿爾茨海默癥，通過(guò)研究此突變對(duì)細(xì)胞表型的影響，可幫助研究者深入研究此疾病的病理，從而開(kāi)發(fā)出更有效的治療方法。研究者將阿爾茨海默癥患者的體細(xì)胞誘導(dǎo)為多能干細(xì)胞（iPSC），然后通過(guò)用野生型序列替換點(diǎn)突變序列，修正突變的基因。通過(guò)研究患者的iPSC和修正后的iPSC，可以得知該突變對(duì)細(xì)胞表型的影響，從而深入研究該突變的病理性作用。 CRISPR-U?可以通過(guò)使用核轉(zhuǎn)染法高效地將gRNA載體（含Cas9）和Donor共轉(zhuǎn)入細(xì)胞中，gRNA和Cas9復(fù)合物造成靶位點(diǎn)DNA雙鏈斷裂后，iPSC細(xì)胞以外源攜帶野生型序列的Donor作為模板進(jìn)行同源重組修復(fù)（HDR），將目標(biāo)序列重組到基因組點(diǎn)突變的靶位點(diǎn)上。（Pires, C., et al.）

病人細(xì)胞構(gòu)建iPSC疾病模型，使用CRISPR/Cas9修復(fù)引起疾病的點(diǎn)突變位點(diǎn)，深入研究點(diǎn)突變的病理性作用

目前治療血友病最普遍的方法是替代療法，但這種方法有病毒感染的風(fēng)險(xiǎn)，且是一種需要終生持續(xù)治療的方法。只有基因治療才能從根本上治愈血友病，CRISPR/Cas9系統(tǒng)可用于血友病的基因治療。細(xì)胞中凝血因子8和9（F8和F9）突變是引起血友病的主要原因。之前就有研究表明F9是更有效的基因治療目標(biāo)。通過(guò)構(gòu)建以AAVS1位點(diǎn)為靶點(diǎn)的AAVS1-Cas9-sgRNA質(zhì)粒和AAVS1-EF1α-F9 cDNA嘌呤霉素donor 載體，并將其導(dǎo)入iPSC中。將F9 cDNA插入AAVS1位點(diǎn)的iPSCs分化為肝細(xì)胞，在培養(yǎng)上清中成功檢測(cè)到人因子IX（hFIX）抗原和活性。最后，通過(guò)脾臟注射將肝細(xì)胞移植到非肥胖糖尿病/嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷病（NOD/SCID）小鼠體內(nèi)，從而起到治療乙型血友病的作用。
CRISPR-U?可以通過(guò)使用通過(guò)核轉(zhuǎn)染法高效地將gRNA、Cas9和Donor共轉(zhuǎn)入iPSC細(xì)胞中，進(jìn)行藥篩，藥篩完成后挑選單克隆培養(yǎng)。選擇不同的克隆分別進(jìn)行靶位點(diǎn)擴(kuò)增及測(cè)序，篩選出敲入純合的陽(yáng)性克隆。（Lyu, Cuicui, et al.）

iPSC 誘導(dǎo)分化，使“自體移植”不再遙不可及

人胚胎干細(xì)胞來(lái)源于早期胚胎而使其研究備受倫理爭(zhēng)議，而且人胚胎干細(xì)胞來(lái)源的分化細(xì)胞進(jìn)行異體移植時(shí)存在排斥反應(yīng)，在一定程度上限制了其臨床應(yīng)用。iPSC可以誘導(dǎo)分化為不同種類的細(xì)胞用于科學(xué)研究。經(jīng)過(guò)日積月累的研究開(kāi)發(fā)，目前已經(jīng)可以從患者組織（如成纖維細(xì)胞）或現(xiàn)有的iPSC中產(chǎn)生具有功能的、成熟的肝細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、T細(xì)胞、心肌細(xì)胞、造血干細(xì)胞和胰島

源井生物的iPSC平臺(tái)

源井生物專注于iPSC重編程、基因編輯、誘導(dǎo)分化的優(yōu)化，已建立一套成熟的實(shí)驗(yàn)流程。結(jié)合源井生物獨(dú)立創(chuàng)新的CRIPSR-U?技術(shù)，打靶效率比傳統(tǒng)方法提高十倍，真正做到“實(shí)驗(yàn)快人一步“！利用CRISPR-U? 的技術(shù)優(yōu)勢(shì)，源井生物已成功在超過(guò)100種細(xì)胞系上實(shí)現(xiàn)基因編輯。