ADC由抗體和通過可裂解或不可裂解連接子偶聯(lián)其上的載荷組成。通常這些載荷對于正常細(xì)胞的細(xì)胞毒性非常大，使其不能被單獨用于化療，但這種高活性藥物偶聯(lián)至抗體后，可以將其導(dǎo)向至腫瘤細(xì)胞并降低其對非靶器官的毒性。ADC中的關(guān)鍵在于選擇合適的抗體，在保持藥物活性的條件下將藥物輸送至腫瘤細(xì)胞。

ADCs抗體的選擇

腫瘤細(xì)胞與正常組織細(xì)胞相比，其細(xì)胞膜表面會高表達(dá)或?qū)Ｒ恍员磉_(dá)某些特異性蛋白分子，用于維持腫瘤細(xì)胞快速增殖。根據(jù)ADC自身的作用特點，適合ADC研發(fā)的理想抗體至少應(yīng)當(dāng)具備以下特點：①僅與腫瘤細(xì)胞表面抗原結(jié)合，與正常組織無交叉反應(yīng)；②與腫瘤細(xì)胞表面抗原具有較高親和力，抗體的親和常數(shù)KD至少在微摩爾/升(μmol/L)水平；③對抗體所結(jié)合的抗原已經(jīng)有比較深入的研究，盡量明確其腫瘤生物學(xué)功能；④盡量使用人源化抗體，減少HAMA反應(yīng)。除此之外，用于制備ADC的抗體要具備一定特性——抗原-抗體復(fù)合物需要能夠介導(dǎo)ADC的內(nèi)化。內(nèi)化后，ADC需要夠被運(yùn)輸至合適的細(xì)胞器（典型的細(xì)胞器為溶酶體）進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)降解以釋放細(xì)胞毒性成殺傷靶細(xì)胞。

在高效的ADC中，抗體的親和力與內(nèi)化速度間無明確的聯(lián)系，雖然傳統(tǒng)的觀點認(rèn)為抗體與抗原的結(jié)合越牢固則內(nèi)化速度越快，從而更適合用于制備ADC。但實際上，高親和力的抗體的內(nèi)化速度可能較中低親和力的更慢，例如曲妥珠單抗具有很高的親和力，而恩美曲妥珠單抗，其抗體部分即為曲妥珠單抗，該ADC內(nèi)化速度相對其他ADC中的抗體來說更慢。

ADCs抗體的內(nèi)化檢測

有多種常規(guī)方法用于檢測內(nèi)化，包括共聚焦顯微鏡、放射性標(biāo)記抗體/ADC檢測和流式細(xì)胞術(shù)等方法。這里簡單介紹使用流式細(xì)胞術(shù)方法評價純化抗體的內(nèi)化，該方法不需使用熒光素或放射性物質(zhì)對待評價抗體進(jìn)行標(biāo)記。

①所需試劑

除非特別說明，所有試劑均存放于4℃；

(1)磷酸鹽緩沖液(PBS)，pH7.2；

(2)0.25%胰酶-EDTA；

(3)FACS染色緩沖液：含2%滅活胎牛血清FBS)的PBS；

(4)純化的候選抗體；

(5)熒光素標(biāo)記的二抗，如Alexa Fluor488標(biāo)記的羊抗人IgG(H+L)二抗；

(6)離心管；

(7)移液器和槍頭；

(8)冰盒；

(9)冷凍超速離心機(jī)；

(10)流式細(xì)胞儀；

(11)振蕩混勻器；

②檢測方法

除非特別說明，所有步驟均需在冰浴或4℃條件下進(jìn)行，檢測所需試劑也需冰浴使用。

(1)收獲細(xì)胞：若細(xì)胞為懸浮細(xì)胞，將細(xì)胞懸液收集于錐形底離心管中；若細(xì)胞為貼壁細(xì)胞，使用胰酶-EDTA使細(xì)胞從培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿上脫落后，將細(xì)胞液置于錐形底離心管中。使用臺盼藍(lán)染色測定細(xì)胞存活率，并于4℃、300g 離心5 min沉淀細(xì)胞，加入FACS染色緩沖洗細(xì)胞一次。再次離心細(xì)胞并使用合適體積的FACS染色緩沖液重懸細(xì)胞，使重懸后細(xì)胞濃度為2X107細(xì)胞/mL。

(2)制備用于染色的細(xì)胞：將細(xì)胞液以50 μL/管(1X106細(xì)胞/mL)分裝至各離心管中。理想情況下，樣品需進(jìn)行兩個樣品或三個樣品的平行檢測，以確保檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。

(3)抗體結(jié)合細(xì)胞：將使用FACS染色緩沖液稀釋的一抗和細(xì)胞懸液合并至終體積100μL，使合并后液體中一抗?jié)庠诤线m范圍內(nèi)(1~20μg/mL)，輕柔振蕩使混后于冰浴中孵育60min。

(4)洗滌未結(jié)合抗體：加入2mL FACS染色緩沖液洗滌細(xì)胞，移除未結(jié)合抗體。4℃ 300g離心5min沉淀細(xì)胞，棄去上清。重復(fù)洗滌2次。

(5)37℃ 孵育使結(jié)合抗體內(nèi)化：每個離心管中加入200μL FACS染色緩沖液后，于37℃孵育15min至2h的不同時間，使結(jié)合于細(xì)胞表面的抗體內(nèi)化。使用另一個在4℃孵育相同時間的樣品管作為無內(nèi)化的陰性對照。在各時間點，將該時間點對應(yīng)的37℃孵育試管移至冰浴，并加入2 mL冰浴FACS 染色緩沖液終止內(nèi)化。同時向4℃孵育的對照試管中加入2mL冰浴的FACS染色緩沖液4℃、300g離心5min沉淀細(xì)胞。

(6)使用熒光標(biāo)記的二抗標(biāo)記結(jié)合于細(xì)胞表面的抗體：在各離心管中加入20μL Alexa Fluor488標(biāo)記的羊抗人IgG(H+L)二抗，4℃避光孵育30min。

(7)洗滌未結(jié)合二抗：加入2mL FACS染色緩沖液洗滌細(xì)胞，移除未結(jié)合抗體。4℃、300g離心5min沉淀細(xì)胞，棄去上清。重復(fù)洗滌2次、將染色后細(xì)胞重于500μL冰浴PBS中。

(8)流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面的熒光強(qiáng)度：為獲得最好的結(jié)果，在細(xì)胞洗滌完成后盡快使用流式細(xì)胞儀分析。

(9)細(xì)胞表面結(jié)合抗體的內(nèi)化水平通過計算37℃孵育樣品相對于4℃孵育對照樣品的平均熒光強(qiáng)度(mean fluorescence intensity，MFI)降低水平得出。計算各時間點37℃孵育樣品和4℃孵育對照樣品的平均熒光強(qiáng)度，計算出內(nèi)化百分比和細(xì)胞表面結(jié)合抗體百分比(%MFI)。