肝細胞癌(HCC)是世界上最常見的惡性腫瘤之一，早期臨床癥狀不明顯、難以診斷，常在發(fā)病的中晚期確診。盡管過去幾十年里，肝細胞癌的治療技術(shù)有明顯的提升，但這類癌癥的侵襲能力和轉(zhuǎn)移能力較強，治療后復(fù)發(fā)率較高，從而導(dǎo)致這類癌癥的死亡率仍然居高不下。目前對肝細胞癌潛在的發(fā)病機制還處于探究階段，可用于治療的方法相對有限，急需尋求更多的治療方法和技術(shù)。腫瘤抑制因子p53在DNA損傷或癌基因異常激活的反應(yīng)中被激活，誘導(dǎo)多種細胞過程，包括細胞周期阻滯、凋亡和衰老，研究表明p53在HCC的發(fā)展中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。

許多非編碼RNA在p53信號網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮重要作用，包括miRNA和lncRNA，然而小核仁RNA(Small nucleolar RNAs, snoRNAs)在p53調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的作用還不太明確。針對這個問題，華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬同濟醫(yī)院肝臟外科中心的?Liang Chu、Xiaoping Chen和Bixiang Zhang課題組合作在期刊《cell death & differentiation》上發(fā)表了題為“Non-coding small nucleolar RNA SNORD17 promotes the progression of hepatocellular carcinoma through a positive feedback loop upon p53 inactivation”的研究論文（IF2020=15.8）。該研究構(gòu)揭示了小核仁RNA SNORD17和p53信號通路在肝細胞癌的中的調(diào)控作用，為肝細胞癌的治療提供了一個新的潛在靶點。

借助GEO數(shù)據(jù)庫（Gene Expression Omnibus database）、Kaplan-Meier分析和?qRT-PCR分析篩選得到了肝細胞癌預(yù)后相關(guān)且在肝細胞癌組織中表達量上調(diào)的的小核仁RNA SNORD17。同時SNORD17在HCC中的高表達與腫瘤體積增大、血管浸潤呈正相關(guān)，推測SNORD17是在HCC臨床檢測中重要的snoRNA（圖1）。

為了進一步研究SNORD17在肝細胞癌中的作用，研究人員構(gòu)建了SNORD17基因敲除的Hep G2細胞（源井生物協(xié)助構(gòu)建）和SNORD17基因敲降的SK-Hep1細胞（圖2 A）。在HCC細胞系中SNORD17基因的敲除和敲降均可顯著抑制細胞增殖、克隆形成和G1/S期轉(zhuǎn)變（圖2 B~E）。流式分選發(fā)現(xiàn)，與對照組細胞相比，SNORD17基因的敲除和敲降均顯著增加了肝癌細胞的凋亡（圖2 F）。為進一步研究SNORD17在HCC生長中的作用，利用HepG2-WT細胞和HepG2-SNORD17-/-敲除細胞建立的皮下異種移植瘤模型，結(jié)果顯示，與對照組相比，在HepG2細胞中敲除SNORD17顯著降低了原位肝腫瘤體積和腫瘤重量（圖2 G）。

上述所使用的HepG2-SNORD17-/-敲除細胞是由源井生物采用雙gRNA法，并獨家CRISPR-U?專利技術(shù)對SNORD17全長序列進行了敲除，最終構(gòu)建的HepG2-SNORD17-/-敲除細胞被用于研究SNORD17在HCC中的作用。源井基于自身豐富的基因編輯經(jīng)驗，利用獨家CRISPR-U?專利技術(shù)構(gòu)建了包含近2000種的KO細胞現(xiàn)貨庫，覆蓋數(shù)千種基因，該研究所使用的SNORD17 HepG2敲除細胞系在庫內(nèi)也有現(xiàn)貨，快至1周到手！如果您有KO細胞的需求，歡迎復(fù)制入庫搜索>>https://www.ubigene.com/product/KO%20Cell%20Line.html

為了探索SNORD17促進肝癌發(fā)展的分子機制，通過mRNA表達譜檢測HepG2細胞中SNORD17敲除后基因表達的變化。對差異表達基因的KEGG和GSEA分析表明，p53信號通路富集程度最高，且與SNORD17表達量呈現(xiàn)相反的趨勢。這些差異表達的基因主要與p53信號通路相關(guān)，參與調(diào)控細胞周期、細胞凋亡和代謝（圖3 A）。Western Blot?檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SNORD17缺失引起p53表達量上調(diào)（圖3 B），若SNORD17過表達則表現(xiàn)出相反的趨勢。Luciferase報告基因檢測發(fā)現(xiàn)，在肝癌細胞中，SNORD17表達量的降低能顯著增強p53的轉(zhuǎn)錄表達（圖3 C）。在HCC細胞中，SNORD17表達量下調(diào)能顯著促進p53下游效應(yīng)因子p21和Puma的轉(zhuǎn)錄表達（圖3 D）。在p53缺失的肝癌細胞中，敲降SNORD17不會影響細胞增殖（圖3 E）和克?。▓D3 F）形成，過表達SNORD17并沒有促進腫瘤組織的生長（圖3 G）。由此可推斷p53可以通過調(diào)控SNORD17的表達進而影響HCC細胞生長。

RNA pull-down試驗發(fā)現(xiàn)，有19種與SNORD17特異性結(jié)合的蛋白，其中的MYBBP1A?和NPM1是富集量最多的蛋白，并被報道參與調(diào)控p53(圖4 A)，RIP檢測證實在細胞內(nèi)MYBBP1A和NPM1能與SNORD17相互結(jié)合發(fā)揮作用(圖4 B)。乙?；揎棇53的激活至關(guān)重要，曾有報道MYBBP1A能促進p53的乙?；?，那在乙?；揎椀倪^程中，SNORD17扮演著怎么樣的角色呢？通過Co-IP等一系列實驗發(fā)現(xiàn)，SNORD17能將NPM1和MYBBP1A同時錨定在核仁內(nèi)部，抑制核質(zhì)中NPM1-MDM2復(fù)合物和MYBBP1A-p53復(fù)合物的形成，分別通過泛素化修飾和乙?；揎椷M而影響p53的活性；同時p53的乙?；揎椧部烧蚍答佉种芐NORD17的轉(zhuǎn)錄（圖4 C）。?

綜上所述，SNORD17通過與MYBBP1A結(jié)合并抑制其轉(zhuǎn)移到核質(zhì)，從而抑制乙?；D(zhuǎn)移酶p300調(diào)節(jié)的p53乙?；NORD17在HCC中調(diào)節(jié)p53的穩(wěn)定性和活性，增加了p53調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的復(fù)雜性，有望成為HCC治療的新靶點。同時該項研究也進一步證實了snoRNAs在腫瘤發(fā)生中的關(guān)鍵作用，并可作為各種癌癥的預(yù)后標志物，這對后續(xù)的癌癥治療研究也起到了一定的借鑒作用。

參考文獻：

[1] Liang J, Li G, Liao J, Huang Z, Wen J, Wang Y, Chen Z, Cai G, Xu W, Ding Z, Liang H, Datta PK, Chu L, Chen X, Zhang B. Non-coding small nucleolar RNA SNORD17 promotes the progression of hepatocellular carcinoma through a positive feedback loop upon p53 inactivation. Cell Death Differ. 2022 Jan 15. doi: 10.1038/s41418-022-00929-w. Epub ahead of print. PMID: 35034103.

源井生物基于傳統(tǒng)的CRISPR/Cas9技術(shù)進一步研發(fā)了CRISPR-U?獨家專利技術(shù)，具有更高的基因編輯效率，目前源井生物已憑借該技術(shù)成功為全球20多個國家與地區(qū)提供了數(shù)千次基因編輯細胞服務(wù)，并成功構(gòu)建了擁有超3000種KO細胞的基因敲除細胞庫，現(xiàn)1周內(nèi)即可獲得成功敲除的KO細胞，輕松實現(xiàn)各類研究。