獲得新鮮的高質(zhì)量的生物樣本，并制備高活性的單細胞懸液是單細胞測序?qū)嶒灥钠鹗键c。能盡可能地獲得新鮮的生物樣本并妥善保存，避免人為操作影響其正常生理狀態(tài)；在隨后的單細胞懸液制備過程中，能保持較高的細胞活力、盡量減少細胞的黏連和聚集、避免細胞破損以及下游分子實驗抑制劑的污染等因素，對于最終獲得高質(zhì)量的單細胞測序結(jié)果至關(guān)重要。

小編將分幾期為大家逐一介紹獲得多種來源的樣本（包括培養(yǎng)細胞、血液樣本和組織樣本等）并制備成高質(zhì)量的單細胞懸液的基本方法和注意事項，旨在幫助您順利完成單細胞測序樣本的收集和單細胞懸液制備過程。

小編提供的高質(zhì)量單細胞懸液基本制備方法和注意事項，針對單細胞測序的大多數(shù)但不能涵蓋所有的樣本種類。對于較為珍貴的細胞和組織樣本，以及需要特殊制備流程（如應用流式細胞術(shù)進行抗原標簽-抗體富集或密度梯度離心等）的細胞和組織樣本，建議您參照相應參考文獻，并及時通過郵箱、電話或微信公眾號的方式與我們進行溝通，制定針對性優(yōu)化的實驗方法。

上機要求

?? 細胞總數(shù)：最終制備得到用于上機的單細胞懸液所含細胞總數(shù)＞1~2×105。如條件允許，可分裝成2-3份作為備份。

???細胞直徑：單細胞懸液所含細胞直徑＜30μm為宜。若細胞直徑過大，對隨后上機過程中的磁珠沉降效率有一定影響。

???細胞活力：最終制備得到用于上機的單細胞懸液所含活細胞比例＞80%，原則上越高越好。死細胞或活力不高的細胞存在mRNA降解及片段化的現(xiàn)象，影響單細胞分離過程中磁珠對mRNA的捕獲，最終影響單細胞轉(zhuǎn)錄組測序質(zhì)量。

???懸液情況：細胞懸液中應避免存在細胞成團、細胞碎片或其它雜質(zhì)等現(xiàn)象。同時、溶液中應避免殘留核酸、EDTA、DnaseⅠ等可能影響后續(xù)分子實驗的物質(zhì)。

備注：如果無法達到上述要求，可與公司技術(shù)支持聯(lián)系優(yōu)化方案。

取樣選擇

對于實體腫瘤，如何取得樣本做單細胞測序?qū)嶒?，才能讓單細胞測序的結(jié)果能更精確更忠實地反映腫瘤組織內(nèi)真實的細胞類型比例和基因表達特征？

對于上圖所示四種取樣方式：A：取不同部位的多個塊狀樣本，分別檢測。B：取不同部位的多個塊狀樣本，混一起檢測。C：取隨機部位的一個橫斷面樣本，進行檢測。D：取隨機部位的一個塊狀樣本，進行檢測。我們推薦的具有更好腫瘤代表性的取樣方式為：A＞B＞C＞D。

取樣操作

為了保持更好的組織活性，再通過手術(shù)獲得用于制備單細胞懸液的組織樣本時，需要注意以下操作細節(jié)。

實驗細節(jié)

???細胞大小、總數(shù)量以及溶液內(nèi)細胞密度都影響一定轉(zhuǎn)速和溫度條件下細胞的離心富集。我們一般推薦的細胞離心條件范圍是300-500×g，5-15min。盡量首先使用相較低的離心速度和較短的離心時間，如不能看到細胞沉淀，可適當提高離心條件。應用低溫離心條件（4℃）有助于在細胞懸液制備過程中維持細胞的高活力。

???由于離心機轉(zhuǎn)子的不同，會導致細胞沉淀在離心管不同部位（水平轉(zhuǎn)子離心機→細胞沉淀在離心管底部；角轉(zhuǎn)子離心機→細胞沉淀在離心管外側(cè)壁）。鑒于少量的細胞沉淀在離心管側(cè)壁時，肉眼較難分辨，并且吸取上清時會附帶吸走部分細胞沉淀。我們推薦使用水平轉(zhuǎn)子離心機，有助于減少在單細胞懸液制備過程中的細胞損失。

???單細胞懸液制備過程中，為了盡可能維持單細胞的高活力狀態(tài)，盡量保持輕柔操作，包括輕柔吸取、吹打細胞懸液，輕柔顛倒混勻離心管中的細胞懸液等。

???細胞活性在單細胞懸液制備過程中會隨時間緩慢下降，因此我們建議在滿足上機條件的前提下，盡量精簡單細胞懸液制備的流程，縮短實驗時間，以減少細胞活性的自然流失。

???在吸取、吹打細胞懸液過程中的產(chǎn)生的機械剪切力對細胞可能造成損傷，為了盡可能降低這種機械剪切力對細胞可能造成的損傷，我們推薦使用寬口的移液器吸頭。

???普通的移液器吸頭和離心管在單細胞懸液制備過程中，容易出現(xiàn)細胞掛壁現(xiàn)象。為了盡可能降低操作過程中細胞數(shù)目損失，推薦使用低吸附的移液器吸頭和離心管。

???細胞計數(shù)和細胞活力測定的結(jié)果極易出現(xiàn)偏差，因此我們推薦盡量使用2種以上的方法進行細胞技術(shù)和細胞活力測定。如采用血球計數(shù)板人工計數(shù)和機器自動化計數(shù)相結(jié)合，臺盼藍染色與熒光染染色的方法相結(jié)合測定細胞活力。