一、百螢Cell Meter 活細胞Caspase 1結(jié)合檢測試劑盒 綠色熒光概述

我們的Cell Meter 活細胞半胱天冬酶活性檢測試劑盒基于半胱天冬酶的熒光抑制劑。這些抑制劑具有細胞滲透性和非細胞毒性。一旦進入細胞，半胱天冬酶與活性半胱天冬酶共價結(jié)合。?Caspase-1主要參與促炎細胞因子的激活和細胞凋亡過程。已經(jīng)證明胱天蛋白酶1對肽序列Tyr-Val-Ala-Asp（YVAD）具有底物選擇性。該試劑盒使用FAM-YVAD-FMK作為半胱天冬酶1活性的熒光指示劑。 FAM-YVAD-FMK在凋亡細胞中不可逆地結(jié)合活化的半胱天冬酶1。一旦與半胱天冬酶1結(jié)合，熒光試劑保留在細胞內(nèi)。結(jié)合抑制胱天蛋白酶1但不會阻止細胞凋亡的進行。

有多種參數(shù)可用于監(jiān)測細胞凋亡。這種Cell Meter 活細胞半胱天冬酶1活性檢測試劑盒旨在通過測量活細胞中的caspase 1活化來檢測細胞凋亡。它用于定量凋亡細胞中活化的半胱天冬酶1活性，或用于篩選半胱天冬酶1抑制劑。綠色標記試劑FAM-YVAD-FMK允許通過熒光顯微鏡，流式細胞儀或熒光酶標儀直接檢測凋亡細胞中活化的半胱天冬酶1。該試劑盒為所有必需組分提供優(yōu)化的分析方案。

二、百螢Cell Meter 活細胞Caspase 1結(jié)合檢測試劑盒 綠色熒光參數(shù)

Ex(nm) ???????493

Em(nm) ???????517

溶? ? ?劑 ?????Water

存儲條件 ?????在-15℃以下保存，避免光照

三、百螢Cell Meter 活細胞Caspase 1結(jié)合檢測試劑盒 綠色熒光適用儀器

?

流式細胞儀

?

激發(fā)：FL1通道

發(fā)射:? ?FL1通道

儀器規(guī)格：用于碘化丙啶的FL2通道

?

熒光顯微鏡

激發(fā)：FITC通道

發(fā)射：FITC通道

通道：黑色透明

?

熒光酶標儀

?

激發(fā)：490nm

發(fā)射：525nm

cutoff:515nm

通道：黑色透明

?

?

四、百螢Cell Meter 活細胞Caspase 1結(jié)合檢測試劑盒 綠色熒光實驗方案

分離細胞的檢測方案

概述

用密度為5×105到2×106個細胞/ mL的測試化合物制備細胞

將FAM-YVAD-FMK以1：150的比例加入到細胞溶液中

在室溫下孵育1小時

將細胞沉淀，用緩沖液或生長培養(yǎng)基洗滌并重懸細胞

在Ex / Em = 490 / 525nm處分析細胞

注：使用前將所有部件在室溫下解凍。?

操作方法

1.根據(jù)您的特異性誘導(dǎo)方案，將細胞培養(yǎng)至適于細胞凋亡誘導(dǎo)的密度，但不超過2 x 106個細胞/ mL。同時，對于每種標記條件，以與誘導(dǎo)群體相同的密度培養(yǎng)非誘導(dǎo)的陰性對照細胞群。以下是一些誘導(dǎo)懸浮培養(yǎng)細胞凋亡的例子：

1）用2μg/ ml喜樹堿處理Jurkat細胞3小時。

2）用1μM星形孢菌素處理Jurkat細胞3小時。

3）用4μg/ ml喜樹堿處理HL-60細胞4小時。

4）用1μM星形孢菌素處理HL-60細胞4小時。

注意：應(yīng)對每個細胞系進行單獨評估，以確定誘導(dǎo)細胞凋亡的細胞密度。

2.通過向FAM-YVAD-FMK（組分A）的小瓶中加入50μLDMSO制備150X FAM-YVAD-FMK DMSO儲備溶液。

3.將150×FAM-YVAD-FMK DMSO儲備溶液（來自步驟1）以1：150的比例添加到細胞溶液中，并將細胞在37℃，5％CO 2培養(yǎng)箱中孵育1小時。

注1：對于FAM-YVAD-FMK標記，細胞可以濃縮至~5×10 6個細胞/ mL。 未使用的150X FAM-YVAD-FMK DMSO儲備溶液應(yīng)分為單次使用的等分試樣并儲存在-20°C。

注2：對于粘附細胞，用0.5mM EDTA輕輕提起細胞以保持細胞完整，并在用FAM-YVAD-FMK孵育之前用含血清的培養(yǎng)基洗滌細胞一次。

注3：適當?shù)姆跤龝r間取決于所用的細胞類型和細胞濃度。 優(yōu)化每個實驗的孵育時間。

4.將細胞以約200g旋轉(zhuǎn)5分鐘，并用1mL洗滌緩沖液（組分B）洗滌細胞兩次。 將細胞重懸于所需量的洗滌緩沖液中。

注1：FAM-YVAD-FMK是熒光的，因此清除任何未結(jié)合的試劑以消除背景非常重要。

注2：對于分離的細胞，應(yīng)將細胞濃度調(diào)節(jié)至每個微量滴定板孔中2-5×10 5個細胞/100μL等分試樣，用于步驟6。

5.如果需要，用DNA染色標記細胞（如用于死細胞的碘化丙錠，或用于細胞核染色的整個群體的Hoechst）。

6.通過熒光顯微鏡，流式細胞儀或熒光酶標儀在Ex / Em = 490 / 525nm處檢測熒光強度（對于碘化丙錠，Ex / Em = 535/635 nm;對于Hoechst染料，Ex / Em = 350 / 461納米）。

6.1對于流式細胞儀，使用FL1通道監(jiān)測熒光強度（FL2通道用于碘化丙錠染色）。

6.2用于熒光顯微鏡和熒光酶標儀。將100μL細胞懸浮液置于96孔黑壁/微量滴定板透明底部的每個孔中。

注意：如果需要平衡細胞濃度，調(diào)整誘導(dǎo)細胞的懸浮體積以接近非誘導(dǎo)細胞群的細胞密度。如果您的細胞治療不會導(dǎo)致受刺激細胞群數(shù)量的顯著損失，則此調(diào)整步驟是可選的。

6.3使用FITC通道在熒光顯微鏡下觀察細胞（用于碘化丙啶染色的TRITC通道，用于Hoechst染色的DAPI通道）。

6.4使用熒光酶標儀，使用Ex / Em = 490 / 525nm（在515nm處截止）底部讀取模式監(jiān)測熒光強度。