別說話

先了解一下背景

外源基因在細(xì)胞中的表達(dá)可分為兩大類。

一、瞬時表達(dá)

瞬時表達(dá)外源DNA不整合到宿主染色體中，雖然可以達(dá)到高水平表達(dá)，但通常只持續(xù)幾天。瞬時表達(dá)所需的人力和時間比穩(wěn)定表達(dá)少，但因?yàn)镈NA攝入率和表達(dá)水平在不同實(shí)驗(yàn)中差異較大，不長久也不穩(wěn)定。

二、穩(wěn)定表達(dá)

穩(wěn)定表達(dá)外源DNA整合到宿主細(xì)胞染色體上，或者相當(dāng)于附加子可持續(xù)存在，可使宿主細(xì)胞長期表達(dá)目的基因。

然而

外源基因整合進(jìn)宿主染色體上的幾率很小，通常發(fā)生隨機(jī)整合，其表達(dá)水平和整合位置有關(guān)，會受周圍染色體元件的影響。

?因此

要獲得高產(chǎn)的穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株往往需要進(jìn)行大量的篩選。

好在，

還有給力的篩選系統(tǒng)可供選擇。

G418 篩選系統(tǒng)

G418 篩選系統(tǒng)是穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株最常見的篩選系統(tǒng)。G418是一種氨基糖類抗生素，其結(jié)構(gòu)與新霉素、慶大霉素、卡那霉素相似，它通過影響核糖體功能而阻斷蛋白質(zhì)合成，對原核和真核等細(xì)胞都有毒性，包括細(xì)菌、酵母、植物和哺乳動物細(xì)胞，也包括原生動物和蠕蟲。當(dāng)載體上的neo基因被整合進(jìn)真核細(xì)胞基因組合適位置后，則能啟動neo基因編碼的序列轉(zhuǎn)錄為mRNA，從而獲得抗性產(chǎn)物氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶的高效表達(dá)，使細(xì)胞獲得抗性而能在含有G418的選擇性培養(yǎng)基中生長。neo基因?yàn)榉菙U(kuò)增性選擇基因，不影響目的基因拷貝數(shù)。G418篩選系統(tǒng)已在基因轉(zhuǎn)移、基因敲除、抗性篩選以及轉(zhuǎn)基因動物等方面得以廣泛應(yīng)用，與之作用原理相似的還有潮霉素和嘌呤霉素篩選系統(tǒng)。

而在生物醫(yī)藥領(lǐng)域中主要是利用CHO細(xì)胞的GS或DHFR 篩選系統(tǒng)進(jìn)行抗體藥物、重組蛋白等的生產(chǎn)。

CHO表達(dá)系統(tǒng)

CHO表達(dá)系統(tǒng)是目前應(yīng)用最廣泛的真核表達(dá)系統(tǒng)之一，與其他表達(dá)系統(tǒng)相比，它具有許多優(yōu)點(diǎn)：表達(dá)產(chǎn)物胞外分泌，便于分離純化；具有重組基因的高效擴(kuò)增和表達(dá)能力；CHO細(xì)胞屬于成纖維細(xì)胞，很少分泌內(nèi)源蛋白，利于外源蛋白的分離純化；準(zhǔn)確的轉(zhuǎn)錄后修飾功能，表達(dá)的糖基化藥物蛋白在分子結(jié)構(gòu)、理化特性和生物學(xué)功能方面最接近天然蛋白分子；貼壁生長，有較高的剪切力和滲透壓耐受能力，可進(jìn)行懸浮培養(yǎng)或在無血清培養(yǎng)基中達(dá)到高密度，培養(yǎng)體積能達(dá)到100 L以上。

?改造 CHO細(xì)胞可更好地表達(dá)外源蛋白，外源基因在CHO細(xì)胞中擴(kuò)增是提高表達(dá)水平的重要策略之一。

DHFR基因擴(kuò)增系統(tǒng)

DHFR基因擴(kuò)增系統(tǒng)最常用，當(dāng)攜帶DHFR基因的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞后，或攜帶DHFR基因的標(biāo)志質(zhì)粒與攜帶外源基因的表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染CHO-DHFR-細(xì)胞后，可以得到在選擇培養(yǎng)基生長的細(xì)胞克隆，DHFR可被葉酸類似物氨甲喋呤（Amethopterin，MTX）所抑制，不斷提高M(jìn)TX濃度，絕大多數(shù)細(xì)胞死亡，但在極少數(shù)幸存下來的抗性細(xì)胞中，DHFR基因均得以擴(kuò)增。進(jìn)行性選擇抗氨甲喋呤的細(xì)胞系，結(jié)果會導(dǎo)致與DHFR串聯(lián)在一起的外源基因的共擴(kuò)增，拷貝數(shù)可增加幾百到幾千倍，從而使目的基因高水平表達(dá)，抵消氨甲喋呤的抑制效應(yīng)。更重要的是，擴(kuò)增的區(qū)域遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于DHFR基因本身，即與DHFR基因相鄰的DNA區(qū)域同時被擴(kuò)增。

但是，

它卻有以下缺陷。

表達(dá)細(xì)胞僅限D(zhuǎn)HFR缺陷型細(xì)胞，重復(fù)篩選抗性細(xì)胞費(fèi)時費(fèi)力，去除選擇壓力后，擴(kuò)增基因不穩(wěn)定。細(xì)胞遺傳學(xué)表明，在選擇壓力下，擴(kuò)增基因的大小和結(jié)構(gòu)處在不斷變化之中。在細(xì)胞分裂的不同時間，不同的宿主細(xì)胞和選擇藥物使基因的擴(kuò)增范圍處于不斷變化之中，從100～1000kb不等。即使是同一種細(xì)胞，選擇過程不同，基因擴(kuò)增的范圍也不同。

然而，出現(xiàn)了更有效的擴(kuò)增系統(tǒng)—GS擴(kuò)增系統(tǒng)

GS（谷氨酰胺合成酶）擴(kuò)增系統(tǒng)是新近發(fā)展的更有效的系統(tǒng)，具有更高的擴(kuò)增效率。

這是為什么？

谷氨酰胺合成酶在ATP水解提供能量時，利用細(xì)胞內(nèi)的氨和谷氨酸合成谷氨酰胺，在缺乏細(xì)胞外谷氨酰胺的培養(yǎng)條件下，加入谷氨酰胺合成酶抑制劑甲硫氨酸亞砜（MSX）,可使GS 基因及與之相連的目的基因擴(kuò)增，達(dá)到提高目的基因表達(dá)水平的目的，由于只有多拷貝的GS 編碼基因才能抗MSX, 所以在轉(zhuǎn)染過程中不必使用GS 缺陷型的受體細(xì)胞，而且在正常MSX 濃度下就能篩選到含高拷貝外源基因的轉(zhuǎn)染細(xì)胞，這是GS系統(tǒng)比DHFR 系統(tǒng)優(yōu)越之處，主要哺乳動物細(xì)胞株為CHO-K1細(xì)胞。

加壓擴(kuò)增外源基因表達(dá)，除了單純使用DHFR擴(kuò)增系統(tǒng)或GS擴(kuò)增系統(tǒng)外，也可采用G418與MTX聯(lián)合作用細(xì)胞，G418與MSX（methioninesulphoximine，GS抑制物）聯(lián)合作用細(xì)胞，或者利用DHFR擴(kuò)增系統(tǒng)與GS擴(kuò)增系統(tǒng)共加壓。

你以為這就完了？

No

還有更多篩選系統(tǒng)等你來膜拜

Flp-In系統(tǒng)產(chǎn)生背景

隨著新技術(shù)的不斷革新，針對真核質(zhì)粒轉(zhuǎn)染構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株的方法也不斷地創(chuàng)新，出現(xiàn)了TALEN、IOS、Cas9和Flp-In等技術(shù)，不斷地提高穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株構(gòu)建的成功率。

Flp-In系統(tǒng)以其獨(dú)特的優(yōu)勢，廣泛應(yīng)用于構(gòu)建過表達(dá)或靜默特定基因的穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株，用于特定基因的功能研究。Flp-In系統(tǒng)依據(jù)釀酒酵母的DNA重組系統(tǒng)的特點(diǎn)，高效構(gòu)建穩(wěn)定哺乳動物表達(dá)細(xì)胞株。這種DNA重組系統(tǒng)應(yīng)用重組酶（Flp）和定點(diǎn)重組技術(shù)，將目的基因插入到哺乳動物指定的基因組中。它的優(yōu)點(diǎn)是能構(gòu)建同基因型的穩(wěn)定細(xì)胞株，可以是多克隆穩(wěn)定細(xì)胞株，無需單克隆篩選。

UCOE系統(tǒng)產(chǎn)生背景

在G418、GS及DHFR三個篩選系統(tǒng)中，由于外源基因與宿主基因組發(fā)生的是隨機(jī)非同源重組，當(dāng)外源基因整合位置處于非轉(zhuǎn)錄活躍區(qū)或不穩(wěn)定的區(qū)域時，外源基因會發(fā)生靜默表達(dá)。為了克服位置效應(yīng)帶來的影響，提高篩選成功率及外源基因表達(dá)量，研究者通過基因工程的手段對表達(dá)載體進(jìn)行改造。

UCOE系統(tǒng)是Millipore公司推出的一套表達(dá)篩選系統(tǒng)，UCOE是一個小的DNA片段，源于看家基因的調(diào)控區(qū)域，可以有效防止基因沉默，不論外源基因整合到染色質(zhì)什么位置，目的基因都能持續(xù)穩(wěn)定高水平表達(dá)，成功地克服了位置效應(yīng)的影響。該技術(shù)可以結(jié)合其他篩選系統(tǒng)的抗性基因或選擇標(biāo)記進(jìn)行篩選。

篩選很重要，但實(shí)驗(yàn)流程也不能忽視。

一

載體構(gòu)建

首先，構(gòu)建含目的基因的重組表達(dá)質(zhì)粒。外源基因是以質(zhì)粒DNA的形式進(jìn)入動物細(xì)胞的，同時質(zhì)粒DNA上帶有提高外源基因轉(zhuǎn)錄和翻譯水平的元件。盡管病毒來源的載體和細(xì)菌來源的載體都被用來將外源基因?qū)雱游锛?xì)胞，但是工業(yè)上在構(gòu)建細(xì)胞株的過程中極少用到病毒來源的載體。?目的基因可以由組成型，誘導(dǎo)型或條件型啟動子進(jìn)行啟動轉(zhuǎn)錄。在細(xì)胞分化和發(fā)育的研究中經(jīng)常用到條件型啟動子，它可以由某些特定因素引發(fā)，導(dǎo)致蛋白表達(dá)，影響細(xì)胞的分化。但是在重組蛋白的生產(chǎn)中，絕大多數(shù)表達(dá)載體使用強(qiáng)組成型的啟動子。通常病毒來源的啟動子，如SV40晚期啟動子和CMV啟動子，應(yīng)用最為廣泛。近年來，CHO來源的EF-1和GAPDH的啟動子也被應(yīng)用到蛋白生產(chǎn)中。?此外，密碼子優(yōu)化也可以提高基因的翻譯水平。表達(dá)載體除了包含啟動子、增強(qiáng)子和目的基因外，還需要有篩選標(biāo)記基因或擴(kuò)增標(biāo)記基因，用于后續(xù)篩選。

?二

細(xì)胞轉(zhuǎn)染

通過質(zhì)粒將目的蛋白的編碼基因?qū)氲郊?xì)胞內(nèi)。使用的轉(zhuǎn)染方法主要有DNA-磷酸鈣共沉淀法，電擊法，脂質(zhì)體法。

?三

目的蛋白初步檢測

轉(zhuǎn)染后應(yīng)先確認(rèn)轉(zhuǎn)染效率和蛋白表達(dá)情況。

?四

藥物篩選

應(yīng)該在轉(zhuǎn)染后24 h 至48 h 后再加藥篩選。過早加藥抗性基因沒有獲得足夠表達(dá)，細(xì)胞會發(fā)生大量死亡；過晚加藥陰性細(xì)胞會大量生長。在哺乳動物細(xì)胞中質(zhì)粒不能進(jìn)行復(fù)制，未整合到基因組中的質(zhì)粒會隨著細(xì)胞分裂逐漸丟失。在一段時間的選擇壓力后，所有存活下來的細(xì)胞基因組中都整合了外源質(zhì)粒。這個階段獲得的穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株基本是混合克隆細(xì)胞株，其細(xì)胞間生長速率及基因型存在差異。當(dāng)需要去除細(xì)胞群體干擾因素或需要持續(xù)穩(wěn)定高表達(dá)目的蛋白時，推薦使用單克隆穩(wěn)定細(xì)胞株。

?五

目的蛋白再次檢測

?六

單克隆篩選及鑒定

單克隆來源于含有穩(wěn)定整合外源片段的單個細(xì)胞的擴(kuò)增。單克隆篩選是穩(wěn)定細(xì)胞株篩選的關(guān)鍵步驟。最常用的單克隆篩選方法是LDC法（有限稀釋法）。雖然這種方法費(fèi)時費(fèi)力篩選效率低，但是由于它操作簡單成本低，依然是最普遍使用的方法。

什么是LDC 法？

首先將細(xì)胞懸液稀釋到很低的密度，然后鋪96孔板，使每個孔平均接種1個細(xì)胞。通過顯微鏡觀察，如果單個細(xì)胞一直是活的，且保持分裂狀態(tài)，隨后它便可能產(chǎn)生一個克隆。通常2至3周的時間便可以觀察到克隆的形成。不同種類的細(xì)胞形成克隆的特性不同，對于某些脆弱的細(xì)胞可以適當(dāng)提高鋪板的細(xì)胞數(shù)，來克服細(xì)胞最低生長密度的限制，鋪板時盡量使用分散的單個細(xì)胞懸液，避免細(xì)胞團(tuán)的存在。單克隆形成后，需要結(jié)合Elisa、WB等檢測方法對單克隆進(jìn)行篩選鑒定，對產(chǎn)量高生長狀態(tài)好的單克隆進(jìn)行逐級擴(kuò)大培養(yǎng)。

隨著流式細(xì)胞分選技術(shù)的興起，基于流式細(xì)胞儀的單克隆篩選方法也不斷涌現(xiàn)。主要分以下三類技術(shù)：

細(xì)胞表面分子展示技術(shù)

通過共表達(dá)細(xì)胞表面捕獲分子來篩選高產(chǎn)克隆株。首先可誘導(dǎo)表達(dá)一種膜錨定蛋白，該蛋白可以結(jié)合分泌型目的蛋白，再通過檢測抗體的信號強(qiáng)弱實(shí)現(xiàn)對高產(chǎn)克隆的分選。

胞內(nèi)報告蛋白技術(shù)

對于缺乏合適膜表面篩選標(biāo)記的細(xì)胞也可以利用胞內(nèi)報告蛋白進(jìn)行篩選。例如GFP基因，表達(dá)綠色熒光蛋白，同樣可以和目的基因共表達(dá)。大量研究表明，熒光信號的強(qiáng)度和目的蛋白的表達(dá)水平存在一定的正比例關(guān)系。因此可以通過判斷綠色熒光的強(qiáng)弱來篩選高產(chǎn)細(xì)胞株。

親和力捕獲表面展示技術(shù)

將細(xì)胞表面進(jìn)行生物素標(biāo)記，通過親和素作為橋梁能夠?qū)⒑芏嗌锼鼗目贵w結(jié)合在細(xì)胞表面，生物素化抗體可特異性結(jié)合分泌目的蛋白，再通過熒光標(biāo)記的檢測抗體將信號逐級放大。其中，將細(xì)胞培養(yǎng)在高粘度的培養(yǎng)基中最大限度地避免了細(xì)胞間的交叉反應(yīng)。

基于流式細(xì)胞儀分選技術(shù)的單克隆篩選方法能實(shí)現(xiàn)高通量篩選，效率高，但有時篩選的熒光信號高的細(xì)胞并不是絕對的高產(chǎn)量細(xì)胞株。除了流式細(xì)胞儀分選外還有一些全自動的單克隆篩選儀器可供選擇。

?七

擴(kuò)大培養(yǎng)

對單克隆進(jìn)行篩選鑒定后需要對產(chǎn)量高生長狀態(tài)好的單克隆進(jìn)行逐級擴(kuò)大培養(yǎng)。

?八

穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株定性定量檢測

?九

穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株質(zhì)量控制

穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株質(zhì)量控制應(yīng)主要從以下三個方面進(jìn)行考慮：（1）操作因素的影響：比較凍存前后細(xì)胞生長狀態(tài)、活率及目的蛋白表達(dá)水平的變化。（2）傳代/擴(kuò)增過程的穩(wěn)定性：可將復(fù)蘇的庫細(xì)胞連續(xù)傳代培養(yǎng)至一定的代次和將工作庫細(xì)胞在模擬實(shí)際生產(chǎn)條件下連續(xù)培養(yǎng)、擴(kuò)增（逐級放大擴(kuò)增過程），直至預(yù)期培養(yǎng)時間以及超過預(yù)期時間之外的延長時間點(diǎn)，收獲后進(jìn)行檢測分析。通過考察目的基因、表達(dá)框架等在重組工程細(xì)胞中的傳代穩(wěn)定性和目的產(chǎn)物表達(dá)的穩(wěn)定性，制定庫細(xì)胞的限傳代次和生產(chǎn)細(xì)胞的增殖限度以保證實(shí)際生產(chǎn)過程中細(xì)胞整體擴(kuò)增水平。（3）安全性考察：應(yīng)定期對細(xì)胞庫和工作過程中細(xì)胞進(jìn)行細(xì)菌、真菌和支原體檢測。用于生物藥生產(chǎn)的細(xì)胞株還應(yīng)對細(xì)胞來源宿主動物潛在的內(nèi)源性病毒和由于操作帶入的外源性病毒進(jìn)行檢測。

?十

凍存細(xì)胞工作庫

穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株篩選周期長，一般在3個月左右。在整個篩選過程中要對關(guān)鍵步驟獲得的細(xì)胞進(jìn)行凍存。對用于生物醫(yī)藥生產(chǎn)的細(xì)胞株，在選定生產(chǎn)用細(xì)胞株之后，需要建立主細(xì)胞庫（mater cell bank）。從主細(xì)胞庫復(fù)蘇后，擴(kuò)增建立工作細(xì)胞庫（working cell bank），工作細(xì)胞庫用于生產(chǎn)。細(xì)胞庫通常保存在液氮中，需要維持整個產(chǎn)品的生命周期。

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