組培苗的玻璃化及防治

在進(jìn)行植物組織培養(yǎng)時(shí)，經(jīng)常會(huì)發(fā)現(xiàn)試管苗生長(zhǎng)異常，表現(xiàn)為試管苗葉、嫩梢呈水晶透明或半透時(shí)，水浸狀；整株矮小腫脹、失綠；葉片皺縮成縱向卷曲、脆弱易碎；葉表缺少角質(zhì)層蠟質(zhì)，沒(méi)有功能性氣孔，不具有柵欄組織，僅有海綿組織。這種試管苗生長(zhǎng)異?，F(xiàn)象就是?“玻璃化”（Vitrification），是植物組織培養(yǎng)過(guò)程中所特有的一種生理失調(diào)或生理病變。玻璃苗中因其體內(nèi)含水量高，干物質(zhì)、葉綠素、蛋白質(zhì)、纖維素和森質(zhì)素含量低、角質(zhì)層、柵欄組織等發(fā)育不全，表現(xiàn)為光合能力和酶活性降低，組織畸形，器官功能不全，分化能力降低，所以很難繼續(xù)用作繼代培養(yǎng)和擴(kuò)大繁殖的材料；生根困難，移栽后也很難成活。

植物微體快速繁殖時(shí)玻璃苗的出現(xiàn)已成為一種很普遍的現(xiàn)象，該苗有時(shí)多達(dá)50%以上，嚴(yán)重影響繁殖率的提高，已成為莖尖脫毒、工廠化育苗和材料保存等方面的嚴(yán)重障礙，造成人、財(cái)、物的極大浪費(fèi)，所以試管苗下班化現(xiàn)象對(duì)植物組織培養(yǎng)的危害是相當(dāng)嚴(yán)重的，也是亟待解決的問(wèn)題。

導(dǎo)致玻璃化的主要因素：

1．材料差異，在不同的種類、品種間，組培苗的玻璃化程度有所差異。

2．激素水平過(guò)高，若細(xì)胞分裂素濃度過(guò)高或細(xì)胞分裂素與生長(zhǎng)素相對(duì)含量高，易引起玻璃化現(xiàn)象。

3．培養(yǎng)基水勢(shì)，培養(yǎng)基中離子種類，比例不適。

4．環(huán)境溫度、光照強(qiáng)度和通氣性。溫度過(guò)低或過(guò)高，光照時(shí)間強(qiáng)度不足及培養(yǎng)容器中空氣濕度過(guò)高，透氣性較差所造成的通氣不良，易造成組培苗含水量高，從而發(fā)生玻璃化現(xiàn)象。

5．瓊脂濃度降低、有雜質(zhì)等。

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常用的防治措施有：

1．增加光照強(qiáng)度和光照時(shí)數(shù)。

2．降低細(xì)胞分裂素含量。在培養(yǎng)基中添加少量聚乙烯醇、脫落酸等物質(zhì)，能夠在一定程度上減輕玻璃化的現(xiàn)象發(fā)生。

3．增大培養(yǎng)基中瓊脂的含量，以降低培養(yǎng)基的水勢(shì)。

4．降低NH4+濃度，減少培養(yǎng)基中含氮化合物的用量。

5．增加容器通風(fēng)，最好進(jìn)行?CO2施肥，這對(duì)減輕組培苗玻璃化的現(xiàn)象有明顯的作用；降低培養(yǎng)溫度，進(jìn)行變溫培養(yǎng)，有助于減輕組培苗玻璃化的現(xiàn)象發(fā)生。

組培苗的黃化及防治

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組培苗的黃化

黃化是指在組培過(guò)程中由于培養(yǎng)基成分、環(huán)境、激素、碳水化合物等各種因素引起的幼苗整株失綠，全部或部分葉片黃化、斑駁。這一現(xiàn)象在植物組織培養(yǎng)中比較常見(jiàn)，特別在部分木本植物、花卉中較為常見(jiàn)。

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影響組培苗黃化的因素

1、培養(yǎng)基中Fe的含量不足, 各礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)不均衡；

2、培養(yǎng)環(huán)境通氣不良，瓶?jī)?nèi)乙烯含量升高；

3、激素配比不當(dāng)；

4、PH值變化過(guò)大；

5、糖用量不足或長(zhǎng)時(shí)間不轉(zhuǎn)移糖已耗盡；

6、培養(yǎng)溫度不適；光照不足等。

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防治組培苗黃化的方法

1、首先在配制母液和培養(yǎng)基的制作過(guò)程中，要檢查儀器設(shè)備是否準(zhǔn)確，還要認(rèn)真細(xì)致地核對(duì)每項(xiàng)稱量的每一個(gè)環(huán)節(jié)；

2、使用透氣的封口膜以改善瓶?jī)?nèi)通氣狀況；

3、適當(dāng)調(diào)節(jié)pH值、激素配比和無(wú)機(jī)鹽濃度；

4、配制培養(yǎng)基時(shí)切記不要忘記加糖,及時(shí)轉(zhuǎn)接培養(yǎng)物；

5、控制培養(yǎng)室內(nèi)的溫度,適當(dāng)增加光照；

6、在培養(yǎng)基中添加抗生素類物質(zhì)如青霉素、鏈霉素、頭孢霉素等，有時(shí)也會(huì)出現(xiàn)幼苗黃化現(xiàn)象，應(yīng)適當(dāng)減少用量或停止使用。

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組培苗的褐變及防治

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組培苗的褐變

很多種類的植物體中含有大量多酚類化合物，切取芽時(shí)的創(chuàng)傷會(huì)激活組織中的多酚氧化酶，將多酚類物質(zhì)氧化為棕褐色的醌類物質(zhì)，使外植體的切口處發(fā)生褐變，產(chǎn)生可見(jiàn)的茶色、褐色或黑色，此即謂“酚污染”。醌類物質(zhì)會(huì)滲透到培養(yǎng)基中，使培養(yǎng)基褐化，其結(jié)果是嚴(yán)重影響培養(yǎng)物的生長(zhǎng)和分化，甚至造成培養(yǎng)物死亡。在木本植物，尤其是熱帶木本植物及少量草本植物中，此現(xiàn)象較為嚴(yán)重。

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影響褐變的因素

植物的種類褐基因型、外植體的來(lái)源和生理狀況以及培養(yǎng)基的成分都會(huì)不同程度的影響褐變的程度。一般木本植物的外植體比較容易產(chǎn)生褐變現(xiàn)象，在成年樹(shù)尤其嚴(yán)重。培養(yǎng)基中含酚過(guò)高會(huì)導(dǎo)致褐變，含過(guò)高濃度的無(wú)機(jī)鹽和肌醇也會(huì)加劇外植體的褐變。6-芐氨基嘌呤（6-BA）和激動(dòng)素（KT）也有誘導(dǎo)褐變的作用。強(qiáng)光和高溫同樣會(huì)促進(jìn)褐變現(xiàn)象。

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防治褐變的方法

1、在培養(yǎng)基中加入抗氧化劑是防止褐變的有效措施。

常用的抗氧化劑有抗壞血酸（VC）、檸檬酸、半胱氨酸、二硫蘇糖醇和聚乙烯吡咯烷酮（PVP）等，該類藥劑一般需用濃度為50-200mg/L。

具體方法如下：

（1）用經(jīng)過(guò)濾滅菌的抗氧化劑溶液洗滌剛切割的外植體傷口表面；

（2）將抗氧化劑加入固體培養(yǎng)基的表層；

（3）將剛切割的外植體浸入其中一定時(shí)間，

（4）或者在抗氧化劑溶液中切割和剝離外植體。

（5）必要時(shí)還可以將幾種抗氧化劑結(jié)合使用。

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2、在培養(yǎng)基中加入活性炭，吸附對(duì)生長(zhǎng)有抑制作用的褐色醌類物質(zhì)。

?一般認(rèn)為，活性碳主要吸附非極性物質(zhì)及色素大分子，可以減少一些有害物質(zhì)的影響，但是具體吸附的選擇性很差，溫度低時(shí)吸附力增強(qiáng)，溫度高時(shí)吸附力減弱，甚至?xí)馕?。通?；钚蕴康氖褂脻舛葹?.5-10g/L。大量活性炭的加入會(huì)削弱瓊脂的凝固能力，因此要多加些瓊脂；很細(xì)的活性炭容易沉淀，因此通常在瓊脂將要凝固時(shí)，需輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)瓶；應(yīng)當(dāng)注意的是：活性炭也能吸附培養(yǎng)基中的激素類物質(zhì)，影響莖尖的分化和生長(zhǎng)，因此在使用活性炭的場(chǎng)合，需要適當(dāng)提高培養(yǎng)基中激素的濃度。

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3、不斷地（每隔1～2d）將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到新鮮的培養(yǎng)基上，以擺脫老培養(yǎng)基中褐色物質(zhì)的不利影響。在使用液體培養(yǎng)基的情況下，這種方法相當(dāng)有效。

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4、為了防止外植體的褐變，需要選取酚類化合物含量較低的實(shí)驗(yàn)材料，選擇無(wú)機(jī)鹽含量較低，不加肌醇的培養(yǎng)基，并在較弱的光線或黑暗的條件中進(jìn)行培養(yǎng)。

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5、易發(fā)生褐變的植物在進(jìn)行組織培養(yǎng)時(shí)，先進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)（即培養(yǎng)在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中）2-3天（如果分泌物多，如利用花魔芋的球莖進(jìn)行組織培養(yǎng)時(shí)，適當(dāng)延長(zhǎng)預(yù)培養(yǎng)時(shí)間并多次更換培養(yǎng)基），再培養(yǎng)到添加了激素的培養(yǎng)基上。

組培常遇見(jiàn)的問(wèn)題

兩次培養(yǎng)基用的配方都一樣，為什么一個(gè)凝固的特好，一個(gè)就凝固不了？

培養(yǎng)基的凝固與否無(wú)外乎有下列幾種情況：

1、瓊脂批次有變，沒(méi)有做批次試驗(yàn)，沿用以前的用量造成不足。

2、大量元素重復(fù)加入，或大量元素母液配制時(shí)出錯(cuò)。

3、pH值調(diào)的過(guò)低，或有活性炭高壓滅菌時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，造成蔗糖分解量劇增，影響培養(yǎng)基的pH值降低較多。

4、加入新的天然附加物，或附加物過(guò)多。

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75%的酒精和70%的酒精有什么區(qū)別，組培時(shí)用哪種好?

酒精的70%和75%都是可以的，但往往由于桶裝酒精的濃度達(dá)不到95%，這樣按照70%的配制就達(dá)不到要求了，因此我們一般是桶裝按照75%的配，瓶裝則按照70%的配。

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大型滅菌器在滅菌的時(shí)候總會(huì)出現(xiàn)個(gè)別瓶子破裂的現(xiàn)象，請(qǐng)問(wèn)什么原因？是溫度過(guò)高，壓力過(guò)大，還是內(nèi)部冷熱不均造成的呢？

高壓滅菌造成玻璃瓶的破裂，特別是大型滅菌裝置，最主要還是在放氣冷卻時(shí)造成的。究其原因，應(yīng)該是在放氣時(shí)，由于容積較大，壓力在不同位置（內(nèi)外部）的變化速度并不相同，致使瓶?jī)?nèi)與瓶外的壓力差距較大，如果是封口膜，表現(xiàn)的可能就是塑料膜的破裂。

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初代培養(yǎng)時(shí)，外植體出現(xiàn)發(fā)白，慢慢枯死，是什么原因？

外植體的初代培養(yǎng)出現(xiàn)這種情況，是比較好理解的。大田植物材料離體以后，進(jìn)入不同環(huán)境中繼續(xù)生存代謝，需要一個(gè)過(guò)渡。

首先，植物材料要吸收培養(yǎng)基的養(yǎng)分，不再是根吸收，鹽類濃度相對(duì)于離體的植物材料的吸收能力可能是過(guò)量的，植物材料褪色就是葉綠素形成受阻和細(xì)胞代謝受阻，另外培養(yǎng)基養(yǎng)分供應(yīng)的有效性滯后，以及植物材料本身內(nèi)含物向培養(yǎng)基的流失等等。建議在初代培養(yǎng)階段最好先采用空白培養(yǎng)。

做無(wú)毒苗的快繁，一直找不到合適的培養(yǎng)基，能不能幫我推薦一種？

關(guān)于組培快繁的方式概括起來(lái)有下列兩種途徑：

1、外植體－愈傷組織－再生芽－繼代－生根－出苗

2、外植體－叢生芽－繼代－生根－出苗

至于采取那種途徑，需要徹底了解所選組培植物的生物習(xí)性，包括繁殖方式，頂端優(yōu)勢(shì)，萌孽生根能力等。

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一般情況下KT的母液應(yīng)該配成多大濃度？IAA能高壓滅菌嗎？高壓滅菌成分會(huì)變嗎？

KT一般配成0.05－0.1ppm。IAA極不耐高壓滅菌，一般采用過(guò)濾滅菌。如果利用高壓滅菌其分解率會(huì)在85%以上，致使其作用不明顯。

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請(qǐng)問(wèn)植物病毒檢測(cè)的簡(jiǎn)便方法？

由于經(jīng)過(guò)脫毒處理，即使未完成脫除病毒的植株，其體內(nèi)病毒的含量也會(huì)較低，常常在最初的一、二次病毒檢測(cè)中呈陰性，因此有人建議在前18個(gè)月內(nèi)，必須對(duì)植株進(jìn)行若干次檢測(cè)。目前常用的植物病毒檢測(cè)方法有可見(jiàn)癥狀鑒定、寄生鑒別、抗血清檢測(cè)、電鏡檢測(cè)、分子檢測(cè)等。

可見(jiàn)癥狀鑒定法較簡(jiǎn)單，但準(zhǔn)確性差，對(duì)于不表現(xiàn)可見(jiàn)癥狀的隱癥病毒幾乎無(wú)效；而電鏡檢測(cè)、分子檢測(cè)雖然檢測(cè)準(zhǔn)確率高，但設(shè)備昂貴，尤其電鏡不可能每個(gè)組培室都配備，故未在生產(chǎn)上廣泛運(yùn)用；目前生產(chǎn)上，國(guó)內(nèi)外仍主要采用鑒別寄主的酶聯(lián)免疫檢測(cè)法檢測(cè)植物病毒。

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組培苗生長(zhǎng)環(huán)境有何特點(diǎn)？如何針對(duì)這些特點(diǎn)提高移栽成活率？

組培苗煉苗是組培過(guò)程中較為重要的一個(gè)環(huán)節(jié)，是一個(gè)較為復(fù)雜的技術(shù)體系，提高煉苗成活率是決定組培成敗和降低組培成本的關(guān)鍵。

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試管苗一般在高濕（100%）、弱光（3000-4000Lux）、恒溫（25℃）下培養(yǎng)，生長(zhǎng)的植株有以下幾個(gè)特點(diǎn)：（1）、葉片無(wú)保護(hù)組織（角質(zhì)層、蠟質(zhì)、表皮毛等），加之細(xì)胞間隙大，氣孔開(kāi)張大，因此水分散失較快，易于萎蔫。(2)、根無(wú)根毛或極少，并且有些從愈傷組織上發(fā)育的根與芽的疏導(dǎo)組織不相同，因此吸水能力較弱。而當(dāng)煉苗移栽時(shí)，環(huán)境有了極大的改變：濕度降低、光照增強(qiáng)、溫度升高、溫差變大。

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具有以上特點(diǎn)的組培苗，在此環(huán)境下，葉片失水較嚴(yán)重，根系吸水能力不足，即吸水量小于蒸騰水量，從而造成植物萎蔫，煉苗失敗。另一種情況是，空氣溫度上升要比基質(zhì)溫度上升快，而根系的吸水能力在一定范圍內(nèi)與溫度是成正比的，當(dāng)氣溫升高時(shí)，加之濕度較低，葉片蒸騰急速增加，此時(shí)基質(zhì)溫度上不去，根系吸水能力不夠，造成蒸騰大于吸水的失衡狀態(tài)，從而萎蔫死亡。

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要想獲得高的煉苗成活率就得針對(duì)以上問(wèn)題，一方面提高出瓶苗的質(zhì)量，提高其抗逆性，生根前的壯苗、理想的生根配方和生根培養(yǎng)環(huán)境的調(diào)控是關(guān)鍵；另一方面就得有針對(duì)組培苗特點(diǎn)創(chuàng)造一個(gè)適宜的煉苗環(huán)境，比如保證空氣濕度，平衡空氣和基質(zhì)的溫度平衡關(guān)系等。

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有些植物在組培生根階段會(huì)把大量元素和糖減半，根據(jù)什么來(lái)判斷是否需要減半？

在組培過(guò)程中，我們提起配方往往只局限于激素的配比和添加物的使用，其實(shí)對(duì)基本培養(yǎng)基的構(gòu)成和培養(yǎng)條件（溫度、光照、濕度、PH等）都屬于配方的范疇。在這方面的調(diào)整主要是根據(jù)實(shí)際培養(yǎng)狀況靈活調(diào)整。在生根階段，試驗(yàn)證明培養(yǎng)基高滲透勢(shì)或液體培養(yǎng)基有利于營(yíng)養(yǎng)素和激素的運(yùn)轉(zhuǎn)，有利于根的發(fā)生和形成，因此大部分植物在生根過(guò)程需要調(diào)整基本培養(yǎng)基的組成。但具體需不需要應(yīng)該通過(guò)對(duì)比試驗(yàn)確定。

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什么是濾紙橋生根？

濾紙橋生根技術(shù)是分化苗直接瓶外生根技術(shù)，其作用主要是簡(jiǎn)化生根環(huán)節(jié)，提高煉苗成活率，降低組培成本，同時(shí)還可以對(duì)污染苗進(jìn)行最大程度的利用。

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人工種芽的形成標(biāo)志是什么，怎樣才能算是一個(gè)完整的人工種芽？

一個(gè)完整的人工種子是由體細(xì)胞胚、人工胚乳和人工種皮三部分組成。

它的優(yōu)勢(shì)在于：

1、培養(yǎng)條件可以人為控制，省地省工，可直接播種。

2、人工種子制作時(shí)，可加入營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑、固氮菌、殺蟲(chóng)劑等。

3、以用于生產(chǎn)人工種子的體細(xì)胞胚，可以利用生物反應(yīng)器大規(guī)模生產(chǎn)，效率極高。

4、一些珍貴種苗或樹(shù)種可以通過(guò)人工種子，加速其生產(chǎn)應(yīng)用。

存在問(wèn)題：

1、并非所有植物都能培育出大量高質(zhì)量的體細(xì)胞胚。

2、目前的人工胚乳和種皮還不夠理想，不能有效防止微生物的腐蝕。

3、人工種子的貯藏問(wèn)題有待于進(jìn)一步完善。

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在組培中胚狀體在外部形態(tài)上是如何與愈傷組織區(qū)別的？

大量實(shí)驗(yàn)證實(shí)，植物體細(xì)胞具有成胚的潛力，由體細(xì)胞形成的胚狀體叫體細(xì)胞胚。一般情況，體細(xì)胞組織形成愈傷組織之后3周內(nèi)，在愈傷組織上出現(xiàn)大量胚，這些胚是由愈傷組織外層細(xì)胞以及深部細(xì)胞起源的。在離體或活體條件下，體細(xì)胞經(jīng)原胚期、球形胚期、心形胚期、魚(yú)雷胚期和子葉期等階段形成的胚叫體細(xì)胞胚狀體。從外植體或愈傷組織表面產(chǎn)生胚狀體的情況較為常見(jiàn)。

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從愈傷組織向球形胚過(guò)渡的標(biāo)志是細(xì)胞的活躍分裂形成一團(tuán)致密的沒(méi)有表皮層的細(xì)胞團(tuán)結(jié)構(gòu)，可以明顯地與疏松的愈傷組織區(qū)分開(kāi)。

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鑒別胚狀體的標(biāo)準(zhǔn)：

1、胚狀體具有極性，也就是說(shuō)胚狀體在發(fā)育的早期階段，在其相反的兩端分化，分別出現(xiàn)莖端和根端，是一種單極性結(jié)構(gòu)。

2、在組織學(xué)上，胚狀體的維管組織與母體植物或外植體的維管組織一般沒(méi)有聯(lián)系，

其維管組織的分布呈“Y”字形。而根或芽的分化，里面長(zhǎng)出原形成層束，與愈傷組織形成的或外植體中的維管組織往往相連。

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如果在配制母液時(shí)，將大量元素和微量元素參在同一個(gè)罐子內(nèi)，會(huì)對(duì)植物有影響嗎？

母液配制，主要是考慮到母液穩(wěn)定性問(wèn)題，根據(jù)化學(xué)反應(yīng)原理，濃度很高的大量元素中的陰離子，對(duì)微量元素的金屬離子來(lái)說(shuō)是過(guò)量的，因此若混在一起，微量元素中的金屬離子會(huì)很容易發(fā)生水解反應(yīng)，生成沉淀，從而失效。長(zhǎng)時(shí)間使用這樣的母液，就會(huì)發(fā)生生理病害，比如缺素癥（黃葉，葉不展，萎縮變脆等）。建議使用干粉式培養(yǎng)基。

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植物組織培養(yǎng)的培養(yǎng)基為什么只用蔗糖而不用葡萄糖？為什么動(dòng)物培養(yǎng)的培養(yǎng)液中用葡萄糖而不用蔗糖？

這個(gè)問(wèn)題應(yīng)該從植物與動(dòng)物的生理機(jī)制去思考。植物與動(dòng)物的最大差別就是植物是自養(yǎng)型的（光合作用），而動(dòng)物是異養(yǎng)型的（外部吸收代謝）。植物光合產(chǎn)物是多糖（二碳糖以上，包括蔗糖），貯藏產(chǎn)物形式是淀粉，而淀粉的合成前體就是蔗糖。蔗糖＝葡萄糖＋果糖，所以蔗糖的合成必須同時(shí)要有葡萄糖和果糖，其實(shí)植物也只能吸收葡萄糖和果糖。

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在組織培養(yǎng)中加入蔗糖，經(jīng)熬煮和高壓滅菌后就會(huì)分解成植物能夠吸收的葡萄糖和果糖形式。其實(shí)這樣看來(lái)在組培中，植物也有部分異養(yǎng)的特點(diǎn)，如果在培養(yǎng)基中缺少任何一種糖的形式，植物在自養(yǎng)能力（光合，呼吸，產(chǎn)物代謝等）較差的情況下，就難免會(huì)影響其生理代謝。與植物不同的，動(dòng)物是異養(yǎng)型的他不需要淀粉的積累，也沒(méi)光合作用，動(dòng)物細(xì)胞本身所處的生理環(huán)境和代謝方式就決定了它對(duì)糖形式的要求了。

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如何利用組培技術(shù)培養(yǎng)一棵未知植物？

作為未知植物的組培，應(yīng)該歸為珍稀植物材料的范疇。一是數(shù)量有限，二是不曾命名，三是無(wú)文獻(xiàn)可查。這種材料如果性狀優(yōu)良，進(jìn)行組培快繁是相當(dāng)必要的。一般可以通過(guò)以下步驟開(kāi)展工作：

1、植物的生物學(xué)性狀，進(jìn)行植物歸類和屬種劃分。

2、確定植物的繁殖方式（分蘗、種子、扦插、根莖等），比較組培繁殖的優(yōu)勢(shì)。

3、根據(jù)植物特性（頂端優(yōu)勢(shì)，萌蘗能力等）確定組培發(fā)生方式。

4、小量無(wú)菌外植體系的建立，確定高效外植體獲得方法。

5、大量外植體群體建立，誘導(dǎo)分化配方設(shè)計(jì)。

6、確定最好分化的繼代配方。

7、生根配方設(shè)計(jì)與確定。

8、試管苗出苗。

9、大田栽植，觀察組培苗生物學(xué)性狀，與母本比較鑒別，確定優(yōu)良性狀的遺傳穩(wěn)定性。

10、工廠化繁殖，市場(chǎng)化運(yùn)作。

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在初代培養(yǎng)階段，成功地誘導(dǎo)出綠色的愈傷組織；進(jìn)行繼代培養(yǎng)時(shí)愈傷組織增殖很快，卻始終沒(méi)有出芽，如何解決不產(chǎn)生不定芽的問(wèn)題？

愈傷組織誘導(dǎo)成功后，如何有效地誘導(dǎo)出不定芽是相當(dāng)重要的。外植體產(chǎn)生愈傷組織的時(shí)間和愈傷生長(zhǎng)的程度，隨不同植物種類和培養(yǎng)條件有較大的差異。有些植物形成不定芽比較容易，能夠直接從外植體受傷的或沒(méi)有受傷的部位分化出不定芽。

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一般認(rèn)為細(xì)胞分裂素/生長(zhǎng)素的比值是控制器官發(fā)生的重要因素，調(diào)整他們的適當(dāng)比值就可以有效的控制愈傷組織的芽、根等器官的分化。在此理論下，愈傷組織誘導(dǎo)不定芽的能力，與愈傷組織的狀態(tài)密切相關(guān)，能夠誘導(dǎo)形成分生細(xì)胞團(tuán)至關(guān)重要，分生細(xì)胞排列較為規(guī)律，較大的在外，越向內(nèi)細(xì)胞越小，排列也越緊密，細(xì)胞質(zhì)濃厚，核相對(duì)較大，這樣的分生細(xì)胞在激素比值調(diào)控的情況下，就很容易形成不定芽。這也就是為什么愈傷組織在繼代的時(shí)候要交替使用不同激素的原因。

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NAA和2，4-D哪個(gè)生長(zhǎng)素促進(jìn)愈傷誘導(dǎo)效果更好？

對(duì)于愈傷誘導(dǎo)和增殖來(lái)說(shuō)，2，4－D效果要比NAA明顯；但有一個(gè)問(wèn)題，很多情況下，2，4－D誘導(dǎo)的愈傷比較難以再生芽。

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滅完菌，凝固好的培養(yǎng)基上面會(huì)有一層水是什么原因？如果將植物材料轉(zhuǎn)接于這樣的培養(yǎng)基中，會(huì)有什么后果？

培養(yǎng)基滅過(guò)菌后或多或少會(huì)有積水現(xiàn)象，一般來(lái)說(shuō)冬天要輕一些。如果積水太多接種的時(shí)候倒出來(lái)，不然容易造成容器壁水珠比較多，影響光照，從而造成玻璃化現(xiàn)象加重。

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在組培中，葉片較易脫落，是什么原因引起的呢？

葉片脫落是對(duì)逆境的一種表現(xiàn)，溫度過(guò)高、透氣不良、培養(yǎng)物過(guò)于密集、久不轉(zhuǎn)移、有害氣體積累（乙烯、氨氣、甲醛）等會(huì)引起植物材料的落葉或黃化。

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空白培養(yǎng)是什么意思？

空白培養(yǎng)在高效外植體系的建立方面是很有用的步驟?？瞻着囵B(yǎng)就是不加任何激素的培養(yǎng)過(guò)程。對(duì)于外植體迅速適應(yīng)瓶?jī)?nèi)環(huán)境和有效外植體群體的建立是很有用的。

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如果芽體只是長(zhǎng)高，不膨大也不分化，有的靜止不動(dòng)，請(qǐng)問(wèn)這會(huì)是什么原因引起的呢?

成活外植體如何成功啟動(dòng)是組培過(guò)程中至關(guān)重要的環(huán)節(jié)之一。由于大田植物材料其激素水平和細(xì)胞活性差距較大，如何迅速將外植體對(duì)培養(yǎng)基條件做出反應(yīng)也有很多方法，首先芽體萌發(fā)時(shí)應(yīng)用赤霉素，黑暗培養(yǎng)，高低激素配合使用等都會(huì)起到很好的效果。

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用幼芽啟動(dòng)用于分化芽的愈傷，NAA與6-BA的比例有一般規(guī)律嗎？還有用2，4-D啟動(dòng)的愈傷再轉(zhuǎn)到只含NAA和6-BA的培養(yǎng)基中，愈傷變?yōu)榫G色，有分化的可能嗎？

離體的愈傷組織是一種正在增生的非組織化的細(xì)胞群，可以從幾乎任何類型的植株獲得。由外植體形成愈傷組織很少是自發(fā)的，它代表創(chuàng)傷反應(yīng)的擴(kuò)展，一般要求在培養(yǎng)基中有生長(zhǎng)素，常常還要求有細(xì)胞分裂素同時(shí)存在。最有效地產(chǎn)生愈傷組織的激素濃度隨所用的植物及器官而異，但其比外植體直接誘導(dǎo)苗所需的濃度要高。

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大多數(shù)植物中愈傷組織可從外植體上分離開(kāi)，并可進(jìn)行繼代培養(yǎng)和連續(xù)繁殖，所使用的培養(yǎng)基中所含的激素水平，與用于誘導(dǎo)愈傷組織時(shí)相同。如果降低激素水平，或適當(dāng)調(diào)節(jié)生長(zhǎng)素對(duì)細(xì)胞分裂素的比例，某些愈傷組織將再生出苗或胚。

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洋蔥也能加在培養(yǎng)基中？能說(shuō)說(shuō)它的機(jī)理嗎？

培養(yǎng)基中添加有機(jī)附加物，如馬鈴薯、香蕉、椰汁等，主要是由于他們含有豐富的糖、蛋白質(zhì)、各種無(wú)機(jī)鹽、維生素以及各種活性物質(zhì)。洋蔥也不例外，除了含有豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)之外，洋蔥還含有豐富的硫化合物，是強(qiáng)有力的抗菌成分，能殺死多種細(xì)菌。

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在壯苗生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)，會(huì)有黃葉出現(xiàn)，葉子都枯了。是什么原因引起的?

組培苗的黃化是由培養(yǎng)基成分、環(huán)境、激素、碳水化合物等各種因素引起的，但這樣的解釋是比較抽象的。我覺(jué)得在壯苗生根階段，由于培養(yǎng)基的變化，特別是激素的改變導(dǎo)致培養(yǎng)基高壓滅菌后PH變化與分化階段是有較大差別的，加之苗子與培養(yǎng)基接觸面積的變小，營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)滯后。所以當(dāng)根長(zhǎng)出來(lái)以后，會(huì)有不同程度的改變。如果解決的話，還應(yīng)該確定一下生根培養(yǎng)基高壓滅菌后的pH變化，進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整，同時(shí)在分化時(shí)進(jìn)行適當(dāng)壯苗調(diào)整也是比較好的方法。

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1、接種前，接種工具要浸泡在酒精中，所使用的酒精濃度是75%還是95%？

2、用新鐵炮百合鱗片作外植體，對(duì)鱗片切割有沒(méi)有什么方法可以減少污染，書(shū)上講根據(jù)極性方向接種到培養(yǎng)基上，怎么判斷極性呢？

3、使用玻璃瓶和不銹鋼的蓋子作為培養(yǎng)容器，透氣性是不是不好，會(huì)影響培養(yǎng)效果嗎？

接種工具接種灼燒前浸泡酒精的濃度，可以是75%也可以是95%的。至于極性指的就是植物材料有趨向發(fā)育的特征。比如是莖繁，靠近莖頂端發(fā)出芽子，遠(yuǎn)離莖頂端會(huì)長(zhǎng)出根。是根繁的話，新芽發(fā)生于近心端，新根發(fā)生于遠(yuǎn)心端。因此在接種時(shí)，盡量不要使材料倒置，盡量保持植物的極性方位，不能將莖端插入培養(yǎng)基內(nèi)。培養(yǎng)容器的透氣性是決定瓶?jī)?nèi)濕度和氣體狀況的主要因素，因此如果過(guò)于密封，使瓶?jī)?nèi)外得不到氣體交換，就會(huì)不同程度的受到影響。建議使用透氣性好的培養(yǎng)容器。

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生化培養(yǎng)箱可以進(jìn)行植物組織培養(yǎng)嗎？它與光照培養(yǎng)箱有什么不同？

光照培養(yǎng)箱主要是模擬植物的光照條件，更適合植物的培養(yǎng)、種子發(fā)芽等的實(shí)驗(yàn)，而生化培養(yǎng)箱更偏重于溫度、濕度的控制，微生物實(shí)驗(yàn)等比較合適。

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高壓滅菌后培養(yǎng)基的pH會(huì)變大還是變??？MS和1/2MS哪種培養(yǎng)基pH變化更大？

培養(yǎng)基滅菌后pH會(huì)降低0.2左右，其主要原因就是有機(jī)物的分解，特別是維生素、氨基酸和糖，因此MS會(huì)比1/2MS培養(yǎng)基pH變化更大。

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內(nèi)生菌造成的污染在外觀上怎么辨別？

內(nèi)生菌是指在其生活史的一定階段或全部階段生活于健康植物的各種組織和器官的細(xì)胞間隙或細(xì)胞內(nèi)的細(xì)菌，可通過(guò)組織學(xué)方法或從嚴(yán)格表面消毒的植物組織中分離或從植物組織內(nèi)直接產(chǎn)生擴(kuò)增出微生物DNA的方法來(lái)證明其內(nèi)生。在植物組織培養(yǎng)中，由于材料內(nèi)部的內(nèi)生細(xì)菌不能被一般的表面消毒方法所清除，隨著材料帶入培養(yǎng)過(guò)程，從而引起的污染稱為內(nèi)生細(xì)菌污染。從污染狀態(tài)來(lái)看，是發(fā)生于植物材料周圍，一般會(huì)由培養(yǎng)基內(nèi)向外延展，并且發(fā)生的時(shí)間也會(huì)比接觸性污染要長(zhǎng)，接觸性的細(xì)菌一般在2－4天表現(xiàn)，內(nèi)生菌則會(huì)超過(guò)4天，并且菌的種類也相對(duì)單一。

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水解酪蛋白有酸水解，有酶水解，在使用過(guò)程中有沒(méi)有區(qū)別，他們的在培養(yǎng)基中的作用是一樣的嗎？

水解酪蛋白（CH）和水解乳蛋白（LH）是多種氨基酸的混合物，對(duì)胚狀體、不定芽的分化有良好的促進(jìn)作用，通常用量在500mg/L，特別是當(dāng)有高水平IAA存在時(shí)更是如此。對(duì)于酪蛋白不管是酸解還是酶解，作用都是一樣的，但考慮到組培苗的異養(yǎng)功能，酸解應(yīng)該更有利于發(fā)揮其作用。

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有些樹(shù)種受傷后會(huì)分泌出一些白色的漿液，比如梓葉槭，不管是莖段還是葉片，只要有傷口的地方都會(huì)有漿液，而這會(huì)加重外植體的褐化，請(qǐng)問(wèn)應(yīng)該怎么處理呢？

這是植物的傷流現(xiàn)象。由于傷流液中含有酚類物質(zhì)，因此在培養(yǎng)中極易引起褐變。許多研究表明，選擇適當(dāng)?shù)耐庵搀w和培養(yǎng)條件是克服褐變的最主要手段。通常外植體應(yīng)有較強(qiáng)的分生能力，在最適宜的細(xì)胞脫分化和再分化培養(yǎng)條件下，使外植體處于旺盛的生長(zhǎng)狀態(tài)，便可大大減輕褐變。適宜的溫度和在全黑暗條件下進(jìn)行培養(yǎng)也可顯著減小外植體的褐變。液體培養(yǎng)和連續(xù)轉(zhuǎn)接也是很好的措施。

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另外，加入一些氧化劑或用抗氧化劑進(jìn)行材料（外植體）的預(yù)處理或預(yù)培養(yǎng)，可大大減輕醌類物質(zhì)的毒害。這些抗氧化劑包括：VC、檸檬酸、硫代硫酸鈉等。此外，0.1％-0.5％活性炭對(duì)吸附酚類氧化物的效果也很明顯。

組培室常用的培養(yǎng)基及其配置

MS培養(yǎng)基

MS培養(yǎng)基是目前使用最普遍的培養(yǎng)基。其具有較高的無(wú)機(jī)鹽濃度，能夠保證組織生長(zhǎng)所需的礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)還能加速愈傷組織的生長(zhǎng)。由于配方中的離子濃度高，在配制、貯存和消毒等過(guò)程中，即使有些成分略有出入，也不會(huì)影響離子間的平衡。MS固體培養(yǎng)基可用于誘導(dǎo)愈傷組織，也可用于胚、莖段、莖尖及花藥的培養(yǎng)，其液體培養(yǎng)基用于細(xì)胞懸浮培養(yǎng)時(shí)能獲得明顯的成功。MS培養(yǎng)基的無(wú)機(jī)養(yǎng)分的數(shù)量和比例比較合適，足以滿足植物細(xì)胞在營(yíng)養(yǎng)上和生理上的需要。因此，一般情況下，不用再添加氨基酸、酪蛋白水解物、酵母提取物及椰子汁等有機(jī)附加成分。和其它培養(yǎng)基的基本成分相比，MS培養(yǎng)基中的硝酸鹽、鉀和銨的含量高，這是它的顯著特點(diǎn)。

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B5培養(yǎng)基

與其他培養(yǎng)基相比，它的主要特點(diǎn)是含有較低的銨，而銨這一營(yíng)養(yǎng)成分可能對(duì)有些培養(yǎng)基有抑制生長(zhǎng)的作用。當(dāng)愈傷組織和懸浮培養(yǎng)中對(duì)B5培養(yǎng)基與MS培養(yǎng)基進(jìn)行對(duì)比培養(yǎng)試驗(yàn)時(shí)，發(fā)現(xiàn)有些植物的愈傷組織和細(xì)胞培養(yǎng)物在MS培養(yǎng)基上生長(zhǎng)得好，有些在B5培養(yǎng)基上生長(zhǎng)得更適宜。

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N6培養(yǎng)基

為水稻的花藥培養(yǎng)設(shè)計(jì)，成分簡(jiǎn)單，硝酸銨含量高，不含鉬，用于花藥(谷物)培養(yǎng)。

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White培養(yǎng)基

為培養(yǎng)番茄根尖培養(yǎng)設(shè)計(jì)，無(wú)機(jī)鹽濃度低，屬于低鹽培養(yǎng)基。適用于生根培養(yǎng)，成熟胚胎培養(yǎng)，后作了改良，多用于本草植物。

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常用培養(yǎng)基母液成分及配置過(guò)程

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培養(yǎng)基母液的各種成分包括大量元素、微量元素、Fe鹽、有機(jī)成分、肌醇、激素等。

大量元素母液的配制(10X，1 L)

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微量元素母液的配置(100X,0.5 L)

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Fe鹽母液的配置(100X,0.2 L)

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有機(jī)成分母液的配置(100X，200ml，無(wú)肌醇)

肌醇母液配置(100X,200ml)?

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激素母液的配置

注意事項(xiàng)?

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配制大量元素母液時(shí)，某些無(wú)機(jī)成分如Ca2+、SO42-、Mg 2+和H2PO4一等在一起可能發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，產(chǎn)生沉淀物。為避免此現(xiàn)象發(fā)生，母液配制時(shí)要用純度高的重蒸餾水溶解，藥品采用等級(jí)較高的分析純，各種化學(xué)藥品必須先以少量重蒸餾水使其充分溶解后才能混合，混合時(shí)應(yīng)注意先后順序。特別應(yīng)將Ca2+、SO42-、Mg2+和H2PO4-等離子錯(cuò)開(kāi)混合，速度宜慢，邊攪拌邊混合。CaCl2·2H2O要在最后單獨(dú)加入，在溶解CaCl2·2H2O時(shí)，蒸餾水需加熱沸騰，除去水中的CO2，以防沉淀。另外，CaCl2·2H2O放入沸水中易沸騰，操作時(shí)要防止其溢出。

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使用電子分析天平時(shí)注意不要把藥品撒到稱盤(pán)上，用完以后，用吸耳球?qū)⑻炱絻?nèi)的臟物清理干凈。

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在配制鐵鹽時(shí)，如果加熱攪拌時(shí)間過(guò)短，會(huì)造成FeS04和Na2-EDTA鰲合不徹底，此時(shí)若將其冷藏，F(xiàn)eSO4會(huì)結(jié)晶析。為避免此現(xiàn)象發(fā)生，配制鐵鹽母液時(shí)，F(xiàn)eSO4和Na2-EDTA應(yīng)分別加熱溶解后混合，并置于加熱攪拌器上不斷攪拌至溶液呈金黃色(約加熱20 - 30 min)，調(diào)pH值至5 .5，室溫放置冷卻后，再冷藏。

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由于維生素母液營(yíng)養(yǎng)豐富，因此貯藏時(shí)極易染菌。被菌類污染的維生素母液，有效濃度降低，并且易給后期培養(yǎng)造成傷害，不宜再用。避免此現(xiàn)象發(fā)生的方法是:配制母液時(shí)用無(wú)菌重蒸餾水溶解維生素，并貯存在棕色無(wú)菌瓶中，或縮短貯藏時(shí)間。

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所有的母液都應(yīng)保存好，若母液出現(xiàn)沉淀或霉團(tuán)則不能繼續(xù)使用。

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計(jì)算時(shí)，要考慮周全，無(wú)論是配置母液時(shí)的計(jì)算還是配置培養(yǎng)基時(shí)吸取量的計(jì)算，都要考慮周全，尤其是母液配置時(shí)的計(jì)算，因?yàn)樨灤┮院蟮膶?shí)驗(yàn)，必須準(zhǔn)確制備。