FITC-Annexin V/PI凋亡試劑盒提供了一種快速簡便的方法，通過標記早期凋亡細胞（綠色）和壞死或晚期凋亡的細胞（紅色）檢測細胞凋亡水平?？梢允褂昧魇郊毎麅x、熒光顯微鏡或其它熒光檢測設(shè)備進行檢測。

本試劑盒可用于細胞因子等誘導(dǎo)的細胞增殖檢測，也可以用于抗癌藥物等對細胞有毒試劑誘導(dǎo)的細胞毒性檢測，或一些藥物誘導(dǎo)的細胞生長抑制檢測。

使用注意事項

Q：為何染色結(jié)果顯示細胞凋亡率過高？

凋亡時間處理過長，使細胞全部死亡。建議重新摸索細胞凋亡條件，使細胞處于不同的凋亡狀態(tài)。

對于貼壁細胞，胰蛋白酶消化時間過長或機械刮擦細胞會暫時破壞質(zhì)膜，使Annexin V能夠與細胞膜胞內(nèi)面上的磷脂酰絲氨酸結(jié)合，導(dǎo)致假陽性染色。建議在胰蛋白酶消化或機械刮擦細胞后，讓細胞在最佳細胞培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基中培養(yǎng)約30分鐘，以恢復(fù)其膜完整性。

Q：實驗結(jié)果使用什么儀器觀察？

實驗結(jié)果可以通過流式細胞儀和熒光顯微鏡進行觀察，但更推薦使用流式細胞儀。因為正常的細胞和凋亡的細胞膜上都有磷脂酰絲氨酸（PS），只是凋亡細胞膜外更多，可以結(jié)合更多的Annexin V，流式細胞儀更靈敏，可以區(qū)分出微小差異，將正常細胞與凋亡細胞分成不同的兩群，但如果用熒光顯微鏡，可能觀察不到這一差別，尤其是貼壁細胞。

Q：這款試劑盒可同時檢測出凋亡率和細胞周期分布嗎？

不可以。檢測細胞凋亡時PI結(jié)合的是核酸，包括DNA和RNA。而PI用于檢測細胞周期時需要只結(jié)合DNA，由于RNA的干擾，用細胞凋亡檢測試劑盒測出來的細胞周期不準。同時，凋亡檢測與周期檢測時PI的工作濃度以及樣本處理都不一樣。

Q：各象限代表的細胞狀態(tài)問題？

Q1：(AnnexinV-染料)-/PI+，此區(qū)域的細胞為壞死細胞。也可能有少數(shù)的晚期凋亡細胞在其中，甚至機械損傷的細胞也包含其中。Annexin V-/PI+越多，實驗結(jié)果越不可信，建議實驗中盡量控制這一象限細胞比例。

Q2: (AnnexinV+染料)+/PI+，此區(qū)域的細胞為晚期凋亡細胞或壞死。

Q3：(AnnexinV-染料)+/PI-，此區(qū)域的細胞為早期凋亡細胞。

Q4：(AnnexinV-染料)-/PI-，此區(qū)域的細胞為活細胞。

Q：如何避免出現(xiàn)假陽性或假陰性現(xiàn)象？

1.消化液中含有EDTA或消化時間過長引起的假陽性或假陰性現(xiàn)象。Annexin V和PS的結(jié)合需要鈣離子，而EDTA是鈣離子螯合劑，使用含有EDTA的胰酶會造成假陰性。其次消化時間不宜過長，吹打細胞要輕柔，因為胰酶的過度消化和機械損傷都會引起細胞膜的損傷，造成假陽性。細胞消化下來后，建議在培養(yǎng)箱中在孵育30min，使細胞膜恢復(fù)完整性，避免假陽性，或者將細胞浸潤在含2% BSA的PBS中，防止進一步的損傷。

2. 如果樣品來源于血液，必須去除血液中的血小板，因為血小板含有PS，能與Annexin V結(jié)合，干擾實驗結(jié)果。

可以使用含有EDTA的緩沖液200g離心去除血小板， 最后細胞多洗幾遍，減小EDTA螯合鈣離子產(chǎn)生的影響。

3. 神經(jīng)細胞膜容易破壞外翻，導(dǎo)致假陽性，所以Annexin V/PI 雙染法流式檢測細胞凋亡不適用于神經(jīng)細胞。

4. 誘導(dǎo)時間過長。一般情況下誘導(dǎo)幾個小時就可以出現(xiàn)早期凋亡，因此通常不需要處理大于48小時以上，誘導(dǎo)時間過長會使營養(yǎng)物質(zhì)耗盡，導(dǎo)致細胞狀態(tài)差，假陽性結(jié)果偏高。

Q：若是暫不檢測OD值，該如何處理？

若暫時不測定 OD 值，可以向每孔中加入 10μL 0.1 M 的 HCl 溶液或者 1% w/v SDS 溶液，并遮蓋培養(yǎng)板避光保存在室溫條件下。24 小時內(nèi)測定，吸光度不會發(fā)生變化。

Q：Annexin V可以用在植物和細菌中嗎？
Annexin V也可以用在植物和細菌中檢測凋亡，具體實驗步驟可參考相關(guān)文獻。