1975年英國(guó)科學(xué)家Milstein和Kohler發(fā)明的雜交瘤技術(shù)將單克隆抗體正式帶入人們視野。從1986年FDA批準(zhǔn)了第一個(gè)用于治療的單克隆抗體到如今，經(jīng)過(guò)30多年的積累，單克隆抗體的研發(fā)已經(jīng)進(jìn)入了黃金時(shí)期。僅2017年一年，F(xiàn)DA和EMA批準(zhǔn)的單克隆抗體藥物就多達(dá)10個(gè)，為歷年最高，而全球累積獲批單抗類(lèi)藥物也已達(dá)到了73個(gè)。

單抗藥物的研發(fā)技術(shù)和平臺(tái)正日漸成熟，其中通過(guò)重組抗體的方式在體外進(jìn)行抗體文庫(kù)的構(gòu)建及篩選已成為單抗藥物研發(fā)的重要手段。由重組抗體技術(shù)分離產(chǎn)生抗體原理上模擬了體內(nèi)抗體產(chǎn)生的過(guò)程：通過(guò)克隆多樣化的抗體基因，基于不同的展示技術(shù)，體外表達(dá)抗體基因，將其基因型與表現(xiàn)型偶聯(lián)，構(gòu)建出具有多樣性的抗體文庫(kù)，再施加選擇壓力篩選出與靶蛋白特異性結(jié)合的單克隆抗體。

在重組抗體的應(yīng)用中，常見(jiàn)的展示技術(shù)包括噬菌體展示技術(shù)、核糖體/mRNA展示技術(shù)、酵母表面展示技術(shù)、桿狀病毒表面展示技術(shù)等等，其中大部分的展示技術(shù)都是基于原核表達(dá)系統(tǒng)，而這些技術(shù)大多只能展示小分子片段抗體，如抗原結(jié)合片段（Fab），單鏈可變區(qū)抗體片段（scFv）等，無(wú)法展示并篩選全長(zhǎng)抗體，且在原核表達(dá)系統(tǒng)中，表達(dá)蛋白過(guò)程中選擇的密碼子與真核細(xì)胞不同，故用原核表達(dá)系統(tǒng)篩選獲得的全長(zhǎng)抗體可能無(wú)法在體內(nèi)獲得高表達(dá)。而利用哺乳動(dòng)物表面展示技術(shù)，可有效的解決在原核表達(dá)系統(tǒng)中出現(xiàn)的問(wèn)題。

哺乳動(dòng)物表面展示技術(shù)的優(yōu)勢(shì)

這種技術(shù)不僅能夠展示全長(zhǎng)抗體，還能夠利用真核表達(dá)系統(tǒng)指導(dǎo)蛋白質(zhì)的正確折疊，提供復(fù)雜的N型糖基化和準(zhǔn)確的O型糖基化等多種翻譯后加工功能，因而展示的抗體在分子結(jié)構(gòu)、理化特性和生物學(xué)功能方面最接近于天然的高等生物蛋白質(zhì)分子，并在哺乳細(xì)胞中穩(wěn)定且高水平的表達(dá)分泌。因此哺乳細(xì)胞展示技術(shù)具有其他技術(shù)沒(méi)有的潛在優(yōu)勢(shì)。

拿最常見(jiàn)的噬菌體展示技術(shù)與之比較，如圖所示：

? ? ? ?同噬菌體展示技術(shù)一樣，哺乳動(dòng)物細(xì)胞表面展示技術(shù)也主要包括兩個(gè)部分：一，構(gòu)建哺乳細(xì)胞表面展示的抗體庫(kù)；二，與靶標(biāo)特異性結(jié)合抗體的富集及篩選。

接下來(lái)是對(duì)這兩大關(guān)鍵步驟的詳細(xì)解讀，

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一、構(gòu)建哺乳細(xì)胞表面展示抗體庫(kù)

構(gòu)建哺乳細(xì)胞表面展示庫(kù)有兩種方法將重組DNA序列轉(zhuǎn)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，一種是利用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，另一種是利用病毒感染宿主菌，包括牛痘病毒，慢病毒等。

1通過(guò)質(zhì)粒介導(dǎo)的文庫(kù)構(gòu)建

???? 目前invitrogen 推出了一款商業(yè)化的哺乳細(xì)胞展示質(zhì)粒載體：pDisplay

為了在細(xì)胞表面展示抗體，該質(zhì)粒將外源抗體DNA融合到了人類(lèi)血小板生長(zhǎng)因子受體（PDGFR）的跨膜區(qū)域。該載體上還包括了胞病毒啟動(dòng)子、小鼠Ig的信號(hào)肽、抗性篩選基因和c-myc標(biāo)簽。其中我們利用scFv羧基末端的c-myc標(biāo)簽來(lái)測(cè)量抗體的表達(dá)水平。人們可將外源基因克隆至載體的多克隆位點(diǎn)，再把質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至哺乳細(xì)胞中進(jìn)行抗體表達(dá)。

pDisplay載體主要功能如圖下所示：

2通過(guò)病毒介導(dǎo)的文庫(kù)構(gòu)建

??? 以慢病毒為例，如下圖：

一般來(lái)說(shuō)，慢病毒介導(dǎo)的外源DNA表達(dá)需要三種質(zhì)粒：表達(dá)載體，包裝載體和pVSV-G質(zhì)粒。其中pVSV-G在胞病毒啟動(dòng)子的控制下表達(dá)VSV-G蛋白（水溶性口炎病毒），VSV-G可以與細(xì)胞膜磷脂成分相互作用，促進(jìn)病毒和細(xì)胞膜的融合。VSV-G不需要細(xì)胞表面受體，可以替代病毒包膜蛋白。為產(chǎn)生高滴度的病毒顆粒，需要利用表達(dá)載體和包裝質(zhì)粒同時(shí)共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，在細(xì)胞中進(jìn)行病毒的包裝，包裝好的假病毒顆粒分泌到細(xì)胞外的培養(yǎng)基中，離心取得上清液后，可以直接用于宿主細(xì)胞的感染，目的基因進(jìn)入到宿主細(xì)胞之后，經(jīng)過(guò)反轉(zhuǎn)錄，整合到基因組，從而高水平的表達(dá)效應(yīng)分子。

二：與靶標(biāo)特異性結(jié)合抗體的富集及篩選

不同于噬菌體展示，哺乳細(xì)胞表面展示利用細(xì)胞分選和細(xì)胞擴(kuò)增來(lái)使目的抗體得到富集，然后利用FACs技術(shù)完成特異性抗體的篩選。

A細(xì)胞分選

? 除了常規(guī)的流式細(xì)胞分選（FACs）外，免疫磁珠分離技術(shù)（MACs）也被用于帶有目的抗體的哺乳細(xì)胞的分選富集。其策略如圖所示：

免疫磁珠法分離細(xì)胞基于細(xì)胞表面抗原能與連接在磁珠上的特異性單抗相結(jié)合，在外磁場(chǎng)中，通過(guò)抗體與磁珠相連的細(xì)胞被吸附而滯留在磁場(chǎng)中，無(wú)該種表面抗原的細(xì)胞由于不能與相連著磁珠的特異性單抗結(jié)合而沒(méi)有磁性，不在磁場(chǎng)中停留，從而使細(xì)胞得以分離。免疫磁珠法分正選法和負(fù)選法，也稱(chēng)陽(yáng)性分選法和陰性分選法。正選法-磁珠結(jié)合的細(xì)胞就是所要分離獲得的細(xì)胞；負(fù)選法-磁珠結(jié)合的細(xì)胞為不需要細(xì)胞。一般負(fù)選法分選較為常見(jiàn)，因?yàn)榇朔椒ǐ@得的所需要的細(xì)胞表面不含有抗體及磁珠的干擾。

B目的抗體的富集及篩選

?帶有目的抗體的哺乳細(xì)胞經(jīng)過(guò)多輪分選，擴(kuò)增后獲得了大量的富集。通過(guò)介導(dǎo)的質(zhì)?；蛘卟《绢w粒將富集的目的抗體DNA轉(zhuǎn)入表達(dá)抗體的哺乳細(xì)胞當(dāng)中，稀釋獲得單細(xì)胞，經(jīng)過(guò)培養(yǎng)，表達(dá)展示所得的單克隆抗體，再通過(guò)流式細(xì)胞檢測(cè)，篩選得到與靶標(biāo)蛋白特異性結(jié)合的單克隆目的抗體。

哺乳細(xì)胞展示技術(shù)雖然具有很多優(yōu)勢(shì)和開(kāi)發(fā)潛力，但仍有不少問(wèn)題有待解決。大部分哺乳細(xì)胞展示抗體庫(kù)的庫(kù)容多樣性只有10^6-10^8，遠(yuǎn)低于噬菌體展示抗體庫(kù)可達(dá)到的10^10-10^11，且操作難度較大，周期較長(zhǎng)，成本也相對(duì)較高。在進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染或者病毒侵染的過(guò)程中，也較難保證只有一種外源DNA進(jìn)入單個(gè)細(xì)胞，可能會(huì)對(duì)后期抗體篩選產(chǎn)生一定的干擾。但不管如何，哺乳細(xì)胞表面展示技術(shù)仍然是單克隆抗體篩選的一個(gè)重要手段。

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