內(nèi)毒素-菌體中毒性物質(zhì)總稱

名詞解釋：
? ? ??◆ 熱原（Pyrogen）：凡是能造成生物機體體溫上升的物質(zhì)均可稱為熱原。
??????◆ 內(nèi)毒素（Endotoxi）：由革蘭氏陰性菌外層細胞膜在死亡或分裂時產(chǎn)生的物質(zhì)。主要成分為脂多糖（LSP, LipoPolySaccharide），其單位為Eu/mg或Eu/U）。內(nèi)毒素是一種熱原，其它可造成體溫升高的熱原還有如：革蘭氏陰性菌的肽葡萄糖（Peptidoglycan），脂磷壁酸質(zhì)（lipoteichoic），物胞壁酰肽（muramyl ?peptides），寄生蟲等。

各種細菌的內(nèi)毒素的毒性作用較弱，大致相同，可引起發(fā)熱、微循環(huán)障礙、內(nèi)毒素休克及播散性血管內(nèi)凝血等。內(nèi)毒素耐熱而穩(wěn)定，抗原性弱?？纱碳C體產(chǎn)生抗體，但無中和作用，形成抗毒素，經(jīng)甲醛處理不能成為類毒素。

內(nèi)毒素是革蘭氏陰性細菌細胞壁中的一種成分，叫做脂多糖。脂多糖對宿主是有毒性的。雖然內(nèi)毒素緊密地嵌入細胞壁中，但也會不斷地向周圍環(huán)境釋放內(nèi)毒素，這種釋放不僅僅是因為細胞的解體和死亡造成的，也會發(fā)生在正常細胞生長和分裂過程中。

內(nèi)毒素不是蛋白質(zhì)，因此非常耐熱。在100℃的高溫下加熱1小時也不會被破壞，只有在160℃的溫度下加熱2到4個小時，或用強堿、強酸或強氧化劑加溫煮沸30分鐘才能破壞它的生物活性。與外毒素不同之處在于：內(nèi)毒素不能被稀甲醛溶液脫去毒性成為類毒素；把內(nèi)毒素注射到機體內(nèi)雖可產(chǎn)生一定量的特異免疫產(chǎn)物（稱為抗體），但這種抗體抵消內(nèi)毒素毒性的作用微弱。

內(nèi)毒素檢測方法選擇的考量

內(nèi)毒素的檢測方法有哪些？

1，凝膠法簡便易操作，有可能無法排除干擾作用；若樣品稀釋到MVD仍不能排除干擾作用，應(yīng)進一步對供試品的前處理進行研究，再用干擾試驗驗證是否能用凝膠法。

2，光度法包括濁度法和顯色法，可定量檢測內(nèi)毒素的含量。能較為準確評估產(chǎn)品在生產(chǎn)過程中污染的相對風險，定量檢測的數(shù)據(jù)不僅有利于追蹤產(chǎn)品質(zhì)量趨勢，還能起到風險預(yù)警的作用，更易達到數(shù)據(jù)完整性的要求。

3，凝膠法常用的反應(yīng)容器為玻璃小試管或安瓿瓶；光度法常用的反應(yīng)容器為測定儀器專用的試管或酶標板。

內(nèi)毒素檢測注意事項

1，實驗前應(yīng)復(fù)核鱟試劑產(chǎn)品的靈敏度和自身凝集時間，因為鱟試劑本身靈敏度的改變或質(zhì)量不符合要求，能影響實驗結(jié)果。

2，細菌內(nèi)毒素工作品效價誤差或不穩(wěn)定，可影響實驗結(jié)果。

3，嚴格使用廠家配備的細菌內(nèi)毒素檢測用水。

4，實驗操作誤差：操作順序和熟練程度尤為重要。一般順序：制備內(nèi)毒素標準溶液、稀釋樣本、溶解鱟試劑、擺放試管、加樣或加試劑、封口恒溫、觀察結(jié)果并記錄。

5，實驗器具的潔凈度影響：硫酸浸泡4h，蒸餾水沖洗，干熱滅菌。

6，實驗條件：潔凈、無塵?？諝饬魍ā?/p>

7，溫度：室溫25±2℃，恒溫水浴溫度為37±1℃。

8，樣本自身干擾，對含有多糖類藥品或培養(yǎng)基上清，應(yīng)選用特異性鱟試劑或普通鱟試劑+G因子抑制劑。pH不在檢測范圍內(nèi)的及時調(diào)整。

內(nèi)毒素檢測的影響因素

試驗條件與操作：培養(yǎng)條件、操作環(huán)境可能引起各次實驗之間、各實驗室之間的結(jié)果差異。

◆?時間：鱟試劑在液態(tài)時不穩(wěn)定，室溫放置太久會影響反應(yīng)靈敏度，加樣結(jié)束后，應(yīng)立即放入恒溫水浴中，延長保溫時間，可提高LAL的靈敏度。5分鐘混合點的活性最強，混合時間越長，活性反而降低，但在三十分鐘以內(nèi)的各混合時間點測定的靈敏度均在規(guī)定范圍內(nèi)。在顯色法中靈敏度與時間有關(guān)，實驗中既要嚴格控制每個環(huán)節(jié)的保溫時間，又要嚴格控制終止時間。

◆?溫度：凝膠試驗規(guī)定的孵化溫度為37℃，實驗證明，保溫在25-41℃，隨著溫度的升高，LAL的靈敏度也隨著升高，在41-46℃之間，對靈敏度無明顯影響；≥48℃會破壞鱟試劑。

◆?pH值：鱟試劑的pH作用區(qū)間是6-8之間，7.0-7.5最佳。

◆?試驗耗材：內(nèi)毒素稀釋不宜用注射器，應(yīng)使用經(jīng)過校正的刻度吸管。且針栓膠塞容易吸附內(nèi)毒素而使其濃度不夠，造成凝膠反應(yīng)不成立。

◆?操作程序：加樣次序可能會出現(xiàn)實驗結(jié)果不成立等問題。

◆?處理作用：不同產(chǎn)品處理和儲存條件可能為出現(xiàn)分析的誤差，鱟試劑溶解后的保存條件等。

供試品

??????● 多糖：β-葡聚糖可以激活G因子使得結(jié)果呈陽性。實驗室常用的酒精、棉球等含有較多的葡聚糖，低于一定濃度的葡聚糖或LAL-RM（反應(yīng)物）不足以使鱟試劑的凝集反應(yīng)產(chǎn)生陽性，但如果有細菌內(nèi)毒素共同作用的情況下，凝集反應(yīng)會變得更為激烈和迅速，很容易使反應(yīng)出現(xiàn)陽性結(jié)果。

??????● 蛋白：
??????〖陽離子蛋白〗：溶菌酶、核糖核酸酶A、以及人的免疫球蛋白G能夠與細菌內(nèi)毒素形成細菌內(nèi)毒素-蛋白復(fù)合體，對細菌內(nèi)毒素有顯著的屏蔽作用，從而影響用鱟法來測定內(nèi)毒素。在測定之前使用蛋白酶K來消化樣品，可使細菌內(nèi)毒素的回收率達到百分之百。
??????〖血紅蛋白〗：人血白蛋白、球蛋白、抗凝血酶Ⅲ均可以激活G因子。研究表明使用一般鱟試劑測定人血白蛋白、球蛋白等血液制品的陽性檢出率明顯高于用去G因子LAL測定的陽性率，而后者與兔熱原檢查結(jié)果基本一致。
??????〖免疫蛋白〗：免疫球蛋白可以激活G因子途徑。

??????● 離子：離子強度較大會引起內(nèi)毒素的聚集，加重低濃度內(nèi)毒素不易分散的問題；另外LAL中的C因子必須在二價陽離子的參與下才能被激活形成活化的C因子。研究發(fā)現(xiàn)鎂離子增強了LAL顯色反應(yīng)，鈣離子濃度大于5mmol/L時抑制反應(yīng)。當溶液中含有EDTA等絡(luò)合劑或抗凝劑時，陽性離子會失去作用，也就會影響測定。

??????● 有機鹽：核酸鈉能像內(nèi)毒素一樣被檢出，出現(xiàn)假陽性干擾。

??????● 透析液：鱟試劑測定透析液中的內(nèi)毒素方法待進一步考察。

??????● 中藥成分：清熱解毒類藥物等能夠干擾LAL試驗。

??????● 生化藥品：氨基酸對鱟試劑有較強的抑制作用。

??????● 其它物質(zhì)：多種凝血因子、蛋白質(zhì)變性物質(zhì)、高糖溶液、絡(luò)合物、電解質(zhì)、維生素、添加劑等都會干擾鱟試劑形成凝膠。

??????● 鱟試劑內(nèi)源性因子：試劑盒內(nèi)部因子干擾。

??????● 試劑質(zhì)量：批次、溶解水、靈敏度等。

綜上所述，內(nèi)毒素檢測方法種類多樣，且影響因素較多，實驗干擾較多，包括實驗的操作步驟，對樣品的處理等等方面，因此會導(dǎo)致自檢數(shù)據(jù)與廠家有所差異。

文章來源：“逍鵬生物”公眾號，作者~VivaCell&BI市場。
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