寫在前面

????????今天推薦的是由天津醫(yī)科大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)系在2016年5月16日發(fā)表于Journal of Clinical Investigation（IF：12.466，JCR 1區(qū)）的一篇文章，通訊作者是Lei Shi教授，研究表明USP7穩(wěn)定組蛋白去甲基化酶PHF8促進(jìn)乳腺癌的發(fā)生。

研究背景

????????組蛋白的翻譯后修飾是通過各種酶促反應(yīng)完成的，在真核細(xì)胞的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能中起著重要作用。組蛋白去甲基化酶PHF8與多種病理疾病有關(guān)，包括X連鎖智力低下和腫瘤發(fā)生。然而，目前還不清楚PHF8的豐度和功能是如何被調(diào)節(jié)的。

摘要部分

????????在這里，作者研究了PHF8與去泛素化酶USP7的物理聯(lián)系。具體來說，作者證明了USP7促進(jìn)了PHF8的去泛素化和穩(wěn)定化，導(dǎo)致了一組基因的上調(diào)，包括細(xì)胞周期蛋白A2，這些基因?qū)?xì)胞生長和增殖至關(guān)重要。編碼USP7的基因也通過正反饋受到PHF8的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)。USP7在乳腺癌中過度表達(dá)，其表達(dá)水平與PHF8和細(xì)胞周期蛋白A2的表達(dá)以及乳腺癌的組織學(xué)等級呈正相關(guān)。作者表明，USP7通過穩(wěn)定PHF8和上調(diào)細(xì)胞周期蛋白A2來促進(jìn)乳腺癌的發(fā)生，并且USP7和PHF8之間的相互作用在DNA損傷期間得到增強(qiáng)。此外，USP7促進(jìn)的PHF8穩(wěn)定使細(xì)胞對基因毒性損傷具有抵抗力，并且是招募BLM和KU70的必要條件，這兩者對DNA雙鏈斷裂修復(fù)都是必不可少的。作者的研究從機(jī)制上將USP7與表觀遺傳調(diào)節(jié)和DNA修復(fù)聯(lián)系起來。此外，這些數(shù)據(jù)支持將USP7和PHF8作為乳腺癌干預(yù)的潛在目標(biāo)，特別是與化療或放療結(jié)合使用。

研究內(nèi)容

1.組蛋白去甲基化酶PHF8與去泛素酶USP7有物理聯(lián)系

????????首先，作者構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)多西環(huán)素誘導(dǎo)（Dox-inducible）整合的FLAG-PHF8的MCF-7細(xì)胞。產(chǎn)生了一個乳腺癌MCF-7細(xì)胞系，允許多西環(huán)素誘導(dǎo)（Dox-inducible）表達(dá)穩(wěn)定整合的FLAG-PHF8。通過收集細(xì)胞提取物并進(jìn)行蛋白質(zhì)譜分析，作者發(fā)現(xiàn)，PHF8與一些蛋白質(zhì)相關(guān)，包括BLM、OGT和HSPA8。蛋白質(zhì)去泛素酶的成員USP7也被確定在含PHF8的蛋白質(zhì)復(fù)合物中，并通過免疫共沉淀實(shí)驗和蛋白質(zhì)分餾實(shí)驗等證明兩者確實(shí)發(fā)生相互作用。

研究結(jié)論：去泛素化酶USP7與組蛋白去甲基化酶PHF8有相互作用。

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2.USP7在功能上與PHF8的穩(wěn)定有關(guān)

????????為了解決USP7和PHF8之間的物理互動和空間共定位的功能意義，作者研究了USP7對PHF8表達(dá)的影響。USP7被敲低或敲除后PHF8的水平在不同細(xì)胞株中明顯降低。此外，USP7敲低下PHF8蛋白表達(dá)的減少并不是因為PHF8 mRNA減少，PHF8蛋白水平的降低可能是通過蛋白酶體介導(dǎo)的蛋白降解機(jī)制，因為該效應(yīng)可被蛋白酶體特異性抑制劑MG132有效阻斷。這些觀察結(jié)果表明，PHF8的穩(wěn)定性是由USP7調(diào)節(jié)的，PHF8是USP7的底物。

研究結(jié)論：USP7控制PHF8穩(wěn)定性。

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3.USP7使PHF8去泛素化? ? ?

????????作者接下來研究是否是USP7催化的PHF8去泛素化的結(jié)果促進(jìn)PHF8的穩(wěn)定。為此，作者產(chǎn)生了兩個穩(wěn)定的MCF-7細(xì)胞系，分別具有Dox誘導(dǎo)表達(dá)的野生型USP7（USP7/WT）和USP7的催化無活性突變體（USP7/C223S）。通過免疫印跡分析，在表達(dá)USP7/WT的細(xì)胞中，PHF8的蛋白水平以Dox劑量依賴的方式急劇增加，而在表達(dá)USP7/C223S的細(xì)胞中，沒有檢測到PHF8蛋白水平的明顯變化。

????????不僅如此，通過穩(wěn)定表達(dá)FLAG-PHF8的HeLa細(xì)胞與Myc-USP7和HA標(biāo)記的野生型泛素（Ub/ WT）或所泛素突變體（Ub/mt）共轉(zhuǎn)染，并用抗FLAG對細(xì)胞裂解液進(jìn)行IP檢測，然后用抗HA進(jìn)行IB檢測，結(jié)果顯示Myc-USP7表達(dá)的增加與泛素化PHF8物種水平的降低有關(guān)。

研究結(jié)論：USP7以PHF8為目標(biāo)進(jìn)行去泛素化，證實(shí)組蛋白去甲基化酶PHF8是去泛素化酶USP7的真正底物的觀點(diǎn)。

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4.USP7促進(jìn)PHF8穩(wěn)定的生物學(xué)功能

????????為了了解USP7促進(jìn)PHF8去泛素化和穩(wěn)定的生物學(xué)意義，作者通過高通量RNA深度測序（RNA-seq）研究了PHF8或USP7缺失的MCF-7細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組。對PHF8和USP7缺失細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行交叉分析，發(fā)現(xiàn)有727個基因的表達(dá)在PHF8和USP7缺失的細(xì)胞中都發(fā)生了改變，這些基因被認(rèn)為是被PHF8和USP7核心調(diào)節(jié)的目標(biāo)。然后，通過KEGG路徑分析，將被USP7和PHF8核心調(diào)控的基因歸入各種信號通路，結(jié)果表明，敲除USP7或PHF8后，CCNA2、TGFB2、DEPDC1B和CCNE2的mRNA水平下降，但BRCA1和CP110的mRNA水平?jīng)]有下降。? ? ?

????????此外，為了確定這些基因是否被PHF8直接鎖定，作者在穩(wěn)定表達(dá)FLAG-PHF8的MCF-7細(xì)胞中，通過定量染色質(zhì)免疫沉淀（qChIP）檢測PHF8對這些基因啟動子的占用情況。結(jié)果顯示，與H3K4me3相似，在CCNA2、TGFB2、DEPDC1B、CCNE2和USP7的啟動子區(qū)域檢測到FLAG-PHF8的招募。此外，MCF-7細(xì)胞的ChIP檢測也檢測到內(nèi)源性PHF8在這些基因啟動子上的占用，這些結(jié)果表明，CCNA2、TGFB2、DEPDC1B、CCNE2和USP7確實(shí)被PHF8鎖定，說明USP7本身通過正反饋受到PHF8的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)。

????????以前的研究表明，USP7是一種染色質(zhì)修飾劑，作用是去除組蛋白H2B賴氨酸120單泛素化（H2BK120ub1）。因此，USP7有可能通過去泛素化H2BK120ub1，與PHF8協(xié)調(diào)，影響基因的激活。為了驗證這一點(diǎn)，作者進(jìn)行了qChIP實(shí)驗，并在MCF-7細(xì)胞中檢查了USP7對上述PHF8目標(biāo)基因的招募情況。作者沒有檢測到USP7在CCNA2、DEPDC1B、TGFB2和CCNE2基因啟動子上的占用。Western blotting結(jié)果顯示，在表達(dá)USP7/WT而不是USP7/C223S的細(xì)胞中，由CCNA2編碼的細(xì)胞周期蛋白A2的蛋白水平以Dox劑量依賴的方式急劇誘導(dǎo)。

研究結(jié)論：USP7通過穩(wěn)定PHF8來調(diào)節(jié)PHF8靶基因的表達(dá)，從而在上游發(fā)揮作用。

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5.USP7/PHF8/cyclin A2軸促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的體外增殖和體內(nèi)乳腺癌的發(fā)生

????????細(xì)胞周期蛋白A2的失調(diào)與錯誤的細(xì)胞增殖和染色體不穩(wěn)定有關(guān)，而且細(xì)胞周期蛋白A2的異常表達(dá)與多種類型的惡性腫瘤有關(guān)，包括乳腺癌、肝癌和肺癌。鑒于作者觀察到USP7介導(dǎo)的PHF8的去泛素化和穩(wěn)定調(diào)節(jié)了細(xì)胞周期蛋白A2的表達(dá)，有理由推測USP7/PHF8信號通路在細(xì)胞增殖和致癌中起作用。為了驗證這一假設(shè)，作者首先用人體組織陣列分析了USP7、PHF8和細(xì)胞周期蛋白A2的蛋白表達(dá)水平。免疫組化染色顯示所有USP7、PHF8和細(xì)胞周期蛋白A2在來自乳腺、結(jié)腸和直腸的癌腫中都有上調(diào)。然后，作者通過免疫組化染色，用包含113個樣本的人類組織陣列分析了USP7、PHF8和細(xì)胞周期蛋白A2的表達(dá)譜。作者發(fā)現(xiàn)，根據(jù)免疫陽性的平均強(qiáng)度和核染色范圍進(jìn)行分析時，USP7和PHF8與細(xì)胞周期蛋白A2一起在乳腺癌樣本中高度表達(dá)，它們的表達(dá)水平與乳腺癌的組織學(xué)等級密切相關(guān)。這些結(jié)果與作者在免疫組化染色中觀察到的蛋白表達(dá)概況一致，并支持USP7本身通過正反饋受PHF8轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的論點(diǎn)。

????????為了進(jìn)一步確定USP7/PHF8/cyclin A2在細(xì)胞增殖和乳腺癌發(fā)生中的作用，作者移植了5種乳腺腫瘤分別感染不同的病毒組合。在接受移植了USP7或PHF8細(xì)胞的無胸腺小鼠中，腫瘤的生長被大大抑制。同時，在USP7缺陷的腫瘤中過度表達(dá)PHF8或在PHF8缺陷的腫瘤中獲得細(xì)胞周期蛋白A2的功能可以恢復(fù)乳腺腫瘤的生長。

研究結(jié)論：USP7/PHF8/cyclin A2軸在促進(jìn)乳腺癌發(fā)生中發(fā)揮作用。

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6.USP7促進(jìn)的PHF8穩(wěn)定在DNA損傷反應(yīng)中進(jìn)行

????????USP7被確定為DNA損傷反應(yīng)（DDR）在維護(hù)基因組完整性和提供DNA損傷耐受性方面的一個關(guān)鍵調(diào)節(jié)器。因此，作者測試了基因毒性侵染是否會對USP7促進(jìn)的PHF8的穩(wěn)定有任何影響，以及USP7/PHF8信號通路本身是否參與了DDR。為此，首先將MCF-7細(xì)胞暴露于6-Gy劑量的X射線照射（IR）。結(jié)果顯示，PHF8的蛋白水平在IR處理后有所增加。同樣，當(dāng)MCF-7細(xì)胞被仿輻射DNA損傷劑新卡西諾?。∟CS）處理時，PHF8的蛋白水平也升高了。然而，qRT-PCR分析顯示，對照組MCF-7細(xì)胞和暴露于IR或NCS的細(xì)胞中PHF8 mRNA的水平是相當(dāng)?shù)?。這些結(jié)果表明，當(dāng)細(xì)胞暴露于DNA損傷時，PHF8的豐度在轉(zhuǎn)錄后水平上受到正常調(diào)節(jié)，這一過程涉及USP7。

????????USP7和PHF8之間的物理互動和功能聯(lián)系受到DNA損傷的影響。為了研究USP7對PHF8的DDR增強(qiáng)穩(wěn)定的功能意義，作者進(jìn)行了多色競爭實(shí)驗。研究發(fā)現(xiàn)敲除 USP7使MCF-7細(xì)胞對IR更敏感。此外，USP7的敲除也使MCF-7細(xì)胞對NCS敏感。同時作者證明PHF8缺乏的細(xì)胞在受到基因毒性傷害時也會明顯受到損害。

研究結(jié)論：USP7促進(jìn)的PHF8穩(wěn)定化在DDR中得到了關(guān)鍵性的作用。

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7.雙鏈斷裂修復(fù)需要USP7促進(jìn)的PHF8穩(wěn)定化

????????為了進(jìn)一步了解USP7促進(jìn)的PHF8穩(wěn)定化在DDR中的作用，作者研究了PHF8是否直接參與斷裂修復(fù)。作者發(fā)現(xiàn)在4-羥基塔莫西芬處理激活A(yù)siSI后，PHF8被招募到斷裂近端部位。這些結(jié)果表明，PHF8在DNA損傷時被動員并被招募到DSB位點(diǎn)。? ? ?

????????為了解決在DSB位點(diǎn)招募PHF8的功能意義，作者研究了PHF8對兩個主要DSB修復(fù)途徑--同源重組（HR）和非同源末端連接（NHEJ）的修復(fù)效率的影響。PHF8的敲除導(dǎo)致HR效率的明顯降低，同時，通過計算發(fā)現(xiàn)PHF8的敲除與GFP陽性細(xì)胞的百分比降低有關(guān)。這些實(shí)驗共同表明，PHF8是哺乳動物細(xì)胞中有效的NHEJ和HR修復(fù)DSBs所必需的。

????????接下來，作者探究PHF8的去甲基化酶活性是否是其參與DNA修復(fù)的必要條件。為此，將內(nèi)切酶I-SceI與針對PHF8 mRNA的3′-UTR的siRNA共同轉(zhuǎn)染到穩(wěn)定表達(dá)野生型PHF8（PHF8/WT）或去甲基化酶活性缺陷的PHF8（PHF8/H247A）的DR-GFP U2OS細(xì)胞。FACS分析顯示，PHF8/WT能夠恢復(fù)由內(nèi)源PHF8敲除引起的HR修復(fù)效率下降，而PHF8/H247A則不能。

研究結(jié)論：雙鏈斷裂修復(fù)需要USP7促進(jìn)的PHF8穩(wěn)定化。

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8.USP7促進(jìn)的PHF8穩(wěn)定化是招募BLM和KU70所必需的

????????為了對USP7促進(jìn)的PHF8穩(wěn)定在DDR中的作用有更多的機(jī)理了解，并解決PHF8在DSB位點(diǎn)招募的功能影響，作者接著探究PHF8是否能影響關(guān)鍵DDR蛋白在斷裂區(qū)的招募。? ? ?

????????作者證明PHF8的缺乏與BLM對紫外激光誘導(dǎo)的DNA病變的招募受損有關(guān)，通過一系列實(shí)驗表明BLM可以有效地與內(nèi)源性PHF8或PHF8/WT共同免疫沉淀，但PHF8/H247A則不能。因此，作者推斷，去甲基化酶的活性是PHF8準(zhǔn)備一個特定的DDR成分所必需的。為了證實(shí)PHF8在DNA末端切除中的作用，作者檢查了單鏈DNA結(jié)合（ssDNA結(jié)合）蛋白RPA的磷酸化，發(fā)現(xiàn)在PHF8敲除后，DNA損傷引起的RPA32的Ser-4和Ser-8的磷酸化明顯減少。這些數(shù)據(jù)表明，PHF8的功能是通過介導(dǎo)BLM的招募來促進(jìn)DNA末端的切除。? ? ?

????????為了確定PHF8如何有助于NHEJ的修復(fù)，作者用紫外線激光微輻照實(shí)驗來監(jiān)測KU70（一種DNA末端結(jié)合蛋白）的積累動力學(xué)。實(shí)驗發(fā)現(xiàn)PHF8的敲除與KU70的招募受損有關(guān)。與PHF8通過其催化活性促進(jìn)NHEJ修復(fù)的觀察一致，PHF8/WT，而不是PHF8/H247A，能夠回補(bǔ)PHF8缺陷的細(xì)胞中KU70招募受損的表型。

????????與PHF8對DDR因子在DSB上的積累的影響相一致，作者還發(fā)現(xiàn)USP7的敲除破壞了BLM、RPA32磷酸化和KU70在斷裂位點(diǎn)的積累。

研究結(jié)論：PHF8是一個新的DSB修復(fù)模塊，它分別通過HR或NHEJ途徑促進(jìn)BLM或KU70的招募和高效的DSB修復(fù)。

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結(jié)論與討論

????????作者證明了組蛋白去甲基化酶PHF8與去泛素酶USP7有物理聯(lián)系并被其穩(wěn)定。表明USP7在乳腺癌中是上調(diào)的，其表達(dá)水平與PHF8相關(guān)。與觀察到的USP7促進(jìn)PHF8的穩(wěn)定與細(xì)胞周期蛋白A2的上調(diào)相一致，表明在臨床乳腺癌樣本中，細(xì)胞周期蛋白A2的表達(dá)水平升高，并與PHF8和USP7的表達(dá)水平呈正相關(guān)。此外，還證明細(xì)胞周期蛋白A2的功能增益能夠回補(bǔ)PHF8敲除引起的體外和體內(nèi)表型?？傊?，這些發(fā)現(xiàn)為理解乳腺癌中細(xì)胞周期蛋白A2的失調(diào)提供了分子基礎(chǔ)。

Thank you!

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原文鏈接：https://www.jci.org/articles/view/85747