CRISPR/Cas9（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）是一種由RNA指導(dǎo)Cas9核酸酶對(duì)靶向基因進(jìn)行編輯的技術(shù)，是現(xiàn)有基因編輯和基因修飾技術(shù)中效率最高、最簡(jiǎn)便、成本最的技術(shù)之一。因?yàn)檫@些特性CRISPR/Cas9技術(shù)已經(jīng)成為當(dāng)今最主流的基因編輯系統(tǒng)，相信研究涉及到基因功能的小伙伴們大多都聽說(shuō)過(guò)這項(xiàng)技術(shù)的“名頭”。

CRISPR/Cas9系統(tǒng)包括兩個(gè)元素：Cas9蛋白和sgRNA（single guide RNA），被廣泛應(yīng)用于基因敲除（Knock-out）、基因敲入（Knock-in）、基因抑制、基因激活、多重編輯以及功能基因組篩選等實(shí)驗(yàn)中。本期內(nèi)容小編將為大家?guī)?lái)CRISPR/Cas9技術(shù)應(yīng)用最為廣泛的基因敲除細(xì)胞系構(gòu)建詳細(xì)流程，請(qǐng)大家搬好小板凳就坐~

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一、基因敲除原理

Cas9可以對(duì)靶基因組進(jìn)行剪切，形成DNA的雙鏈斷裂。在通常情況下，細(xì)胞會(huì)采用高效的非同源末端連接方式（NHEJ）對(duì)斷裂的DNA進(jìn)行修復(fù)。在修復(fù)過(guò)程中通常會(huì)發(fā)生堿基插入或缺失的錯(cuò)配現(xiàn)象，造成移碼突變，（移碼突變：是指DNA分子由于某位點(diǎn)堿基的缺失或插入，引起閱讀框架變化，造成下游的一系列密碼改變，使原來(lái)編碼某種肽鏈的基因變成編碼另一種完全不同的肽鏈序列。）使靶標(biāo)基因失去功能，從而實(shí)現(xiàn)基因敲除。

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二、基因敲除細(xì)胞株構(gòu)建詳細(xì)步驟

1.確定待敲除基因的靶位點(diǎn)

根據(jù)提供的物種、基因名稱或者基因ID在NCBI或ENSEMBLE中進(jìn)查找。找到該基因CDS區(qū)，分析相應(yīng)的基因組結(jié)構(gòu)，明確CDS的外顯子部分。按照基因本身的性質(zhì)及實(shí)驗(yàn)?zāi)康?，選擇候選的待敲除位點(diǎn)，確定待敲除位點(diǎn)。對(duì)于蛋白編碼基因，如果該蛋白具重要結(jié)構(gòu)功能域，可考慮將基因敲除位點(diǎn)設(shè)計(jì)在編碼該結(jié)構(gòu)域的外顯子；如果不能確定基因產(chǎn)物性質(zhì)，可選擇將待敲除位點(diǎn)放在起始密碼子ATG后的外顯子上。

2.設(shè)計(jì)sgRNA

確定好作用的靶位點(diǎn)后，開始設(shè)計(jì)sgRNA序列。一般來(lái)說(shuō)，基因特異的sgRNA模板序列為位于PAM序列 (Proto spacer Adjacent?Motif) 前間區(qū)序列鄰近基序（可以被Cas9蛋白特異性識(shí)別并切割）的20個(gè)nt。例如spCas9蛋白的PAM序列特征為NGG(其中N為任意核苷酸）。因此，sgRNA模板序列選擇非常方便，即使沒(méi)有軟件，小伙伴們也可選擇根據(jù)序列自行設(shè)計(jì)。但目前有很多成熟的sgRNA設(shè)計(jì)網(wǎng)站或軟件，可以一定程度預(yù)測(cè)特定序列的脫靶幾率，所以學(xué)會(huì)運(yùn)用網(wǎng)站和軟件設(shè)計(jì)sgRNA非常重要，推薦網(wǎng)站：Lei Stanley Qi Lab（http://crispr-era.stanford.edu/index.jsp）。

3.構(gòu)建Cas9和sgRNA表達(dá)載體

通常使用質(zhì)粒載體或病毒載體等方法來(lái)將Cas9和sgRNA導(dǎo)入細(xì)胞。目前慢病毒是構(gòu)建基因敲除細(xì)胞株的最佳工具，通過(guò)將編碼Cas9蛋白的序列和sgRNA序列克隆至慢病毒穿梭質(zhì)粒中，再用包裝好的病毒感染細(xì)胞。

4.實(shí)驗(yàn)細(xì)胞感染及基因敲除

利用慢病毒感染實(shí)驗(yàn)細(xì)胞，細(xì)胞成功表達(dá)Cas9和sgRNA。Cas9蛋白在sgRNA引導(dǎo)下對(duì)細(xì)胞基因組的靶標(biāo)基因進(jìn)行切割，最終導(dǎo)致基因完全敲除或在目標(biāo)位點(diǎn)產(chǎn)生突變，達(dá)到基因敲除的目的。

5.篩選敲除陽(yáng)性混合克隆，檢測(cè)敲除效率。

通過(guò)抗性或者熒光篩選獲得多克隆陽(yáng)性細(xì)胞池，由于細(xì)胞的NHEJ機(jī)制具有隨機(jī)性，不同的陽(yáng)性細(xì)胞可能會(huì)形成不一樣的敲除類型。提取部分多克隆陽(yáng)性細(xì)胞基因組通過(guò)PCR進(jìn)行測(cè)序鑒定套峰位置。

注：套峰的位置一定要對(duì)應(yīng)sgRNA的位置。根據(jù)套峰的“復(fù)雜度”可以大概估計(jì)編輯效率。精確的比例可以通過(guò)TA克隆來(lái)計(jì)算；或者通過(guò)T7E1實(shí)驗(yàn)來(lái)定量編輯效率。

6.單克隆敲除株挑選、基因敲除類型及敲除效果鑒定

通過(guò)單克隆挑選方式進(jìn)行進(jìn)一步的單克隆敲除株分選，再逐一鑒定敲除類型，選取與實(shí)驗(yàn)?zāi)康南喾募?xì)胞株進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。最精確的方法：提取增殖的部分單克隆基因組DNA進(jìn)行PCR測(cè)序，測(cè)序結(jié)果可直觀展示編輯位點(diǎn)的DNA序列；WB鑒定，用抗體直接鑒定目的蛋白是否仍有表，這是檢測(cè)基因敲除效果最徹底的方法。

CRISPR/Cas9介導(dǎo)的敲除細(xì)胞株構(gòu)建流程至此結(jié)束，后續(xù)小編還會(huì)為大家?guī)?lái)sgRNA設(shè)計(jì)、敲除效率鑒定方法等實(shí)用干貨內(nèi)容，大家感興趣的話可以持續(xù)關(guān)注~

漢恒專營(yíng)工具病毒十余載，用于CRISPR/Cas9系統(tǒng)的質(zhì)粒和各種病毒工具十分成熟，另外提供敲除細(xì)胞株構(gòu)建服務(wù)，如有需求或有相關(guān)問(wèn)題歡迎隨時(shí)咨詢。