慢性胰腺炎(Chronic Pancreatitis，CP)是各種病因引起的胰腺組織和功能不可逆改變的慢性炎癥性疾病，臨床主要表現(xiàn)為反復發(fā)作的上腹部疼痛和胰腺內(nèi)、外分泌功能不全，病理特征包括胰腺腺泡細胞破壞、間質(zhì)纖維化等。在國內(nèi)，CP發(fā)病率有逐年增高的趨勢，人群中CP的發(fā)病率為每10萬人9.62例，死亡率為萬分之九。胰腺纖維化是胰腺炎的一個獨特的組織病理學特征，表現(xiàn)為正常胰腺組織結構的喪失，并被細胞外基質(zhì)(ECM)中豐富的纖維組織所取代，活化的胰腺星狀細胞(PSCs)在CP的胰腺纖維化中起著至關重要的作用，但PSCs的激活機制尚不明確。

2023年8月25日，華中科技大學趙剛團隊在Gastroenterology（IF=29.4）在線發(fā)表題為“Pancreatic acinar cells-derived sphingosine-1-phosphate contributes to fibrosis of chronic pancreatitis via inducing autophagy and activation of pancreatic stellate cells”的研究論文，研究結果表明受損胰腺腺泡細胞iPACs（injured pancreatic acinar cells）中活化的SPHK1（sphingosine kinase 1）/S1P（sphingosine-1-phosphate）通路通過調(diào)控S1PR2/AMPK/mTOR通路誘導PSCs自噬和活化，促進CP的纖維化發(fā)生，并且缺氧微環(huán)境可能參與了PACs與PSCs在CP發(fā)病中的作用。值得注意的是，本研究使用了漢恒生物提供的自噬雙標慢病毒。

圖1 調(diào)控機制模型圖

首先，作者通過腹腔注射cerulein或胰管結扎（PDL）構建了兩種小鼠模型，各項實驗指標都表明模型小鼠表現(xiàn)出了與CP一樣的慢性炎癥、纖維化、PSC激活等表型，說明cerulein或PDL可以引起CP，CP小鼠模型構建成功。S1P是SPH在SPHK1作用下的磷酸化產(chǎn)物，在CP小鼠觀察到SPHK1和S1P表達量顯著增加，并且SPHK1主要是在腺泡細胞區(qū)域表達，在PSC幾乎不表達。推測SPHK1/S1P信號軸在CP發(fā)展中起作用。所以SPHK1-/-和SPHK1-KD小鼠用cerulein或PDL誘導CP后檢測相關指標，發(fā)現(xiàn)SPHK1敲除或敲低后，S1P表達量下調(diào)，纖維化相關基因、炎癥相關基因的表達量也顯著下調(diào)，胰腺的萎縮和損傷都得到了緩解，說明SPHK1/S1P信號軸可能促進CP的纖維化形成。

圖2 SPHK1-/-和SPHK1-KD小鼠CP發(fā)病機制

PAC和PSC之間的相互作用對于胰腺纖維化的進展至關重要，對離體細胞PAC和內(nèi)皮細胞、巨噬細胞分別進行CCK（cholecystokinin）刺激，模擬CP中的細胞損傷，只有PAC在CCK刺激后SPHK1表達上調(diào)，培養(yǎng)基中S1P含量也增加，并且能誘導PSC激活，排除了在動物體中內(nèi)皮細胞、巨噬細胞激活PSC的可能。作者進一步收集了各種處理條件下的iPAC培養(yǎng)基(CM)來處理PSC，發(fā)現(xiàn)被CCK刺激過的WT小鼠PAC的CM即WT-CMCCK促進PSC中纖維化相關蛋白α-SMA高表達以及增強了PSC的遷移能力，而SPHK1敲除小鼠的PAC（SPHK1-/--CMCCK）、SPHK1敲低的PAC（siSPHK1- CMCCK）、SPHK1抑制劑PF-543處理的PAC經(jīng)CCK刺激后的CM對PSC沒有相似的激活作用，CCK直接刺激PSC，PSC的激活和遷移能力也沒有顯著改變，但是如果S1P重組蛋白直接添加到PSC的培養(yǎng)基中，PSC可以被激活，甚至可以逆轉SPHK1-/--CMCCK、siSPHK1-CMCCK和PF-543-CMCCK對PSC激活的抑制作用。這說明PSC的激活是由iPAC中的SPHK1和S1P驅動的。

圖3 CCK損傷PACs通過SPHK1/S1P信號誘導PSCs激活

那么是哪種受體接受iPAC釋放的S1P信號激活PSC呢？實驗數(shù)據(jù)表明，CP小鼠PSC的S1PR2表達量顯著上調(diào)，而且S1P處理后的PSC中只有S1PR2表達顯著增加，推測S1PR2是S1P誘導PSC激活的受體。隨后，作者驗證了這一推測，S1P或CMCCK誘導的PSC激活和遷移能力增加會被siS1PR2或S1PR2抑制劑JTE013所抑制，S1PR2的確是PSC特異性S1P受體，對于誘導PSC激活至關重要。

S1P或CMCCK誘導的PSC中還觀察到LC3B-II與LC3B-I的比值明顯增大，Beclin1和ATG5的表達增加，SQSTM1的表達減少，即PSC自噬增強，通過自噬抑制劑CQ（CQ能阻斷自噬小體與溶酶體融合）預處理可顯著逆轉SQSTM1的減少，但不能降低Beclin1和ATG5點表達，這種自噬和活性表型的改變與自噬誘導劑雷帕霉素（RAP）作用結果相似。利用漢恒生物的LC3自噬雙標慢病毒LV-mRFP-GFP-LC3檢測發(fā)現(xiàn)S1P或CMCCK誘導的PSC的紅色斑點增加，但綠色斑點沒有增加，和RAP誘導的自噬熒光結果一樣，而經(jīng)自噬抑制劑CQ預處理后，RAP和S1P或CMCCK誘導的PSC紅色、綠色以及merge后的黃色斑點均顯著增加，siS1PR2、siATG5和JTE013能明顯抑制S1P或CMCCK誘導的自噬和自噬體的形成，說明S1P通過S1PR2以RAP的方式誘導PSCs自噬內(nèi)流，CQ能阻斷這一過程。細胞免疫熒光和Transwell測定結果顯示抑制自噬的同時也抑制了S1P或CMCCK誘導的PSC的激活和遷移，說明S1P誘導PSC自噬對PSC的活化有重要作用。

圖4 S1P通過S1PR2介導PSCs自噬激活

既然已經(jīng)證明S1P在調(diào)節(jié)PSCs自噬流中的作用與RAP相似，那么合理猜測S1P也是通過mTOR途徑發(fā)揮作用的，數(shù)據(jù)顯示S1P或CMCCK誘導的PSC中p-mTOR和p-S6的表達顯著降低，mTOR上游調(diào)節(jié)因子AMPK的磷酸化水平顯著增加，JTE-013或AMPK抑制劑可以逆轉激活的AMPK/mTOR通路，結合前面的實驗結果，說明S1P/S1PR2信號通路通過調(diào)節(jié)AMPK/mTOR通路促進PSCs的自噬。

圖5 S1P/S1PR2調(diào)節(jié)AMPK/mTOR通路

胰腺纖維化形成后，胰腺微環(huán)境處于缺血缺氧狀態(tài)。根據(jù)報道，缺氧環(huán)境中，HIF-1α或HIF-2α可誘導SPHK1表達，作者發(fā)現(xiàn)CP小鼠組織的HIF-1α和HIF-2α表達上調(diào)，缺氧處理的PAC中SPHK1和S1P表達也顯著增加，隨后實驗證實了HIF-1α和HIF-2α可以結合SPHK1啟動子，并且缺氧條件會增加HIF-1α和HIF-2α與SPHK1啟動子的結合來促進SPHK1的轉錄，進而PAC CMhypoxia激活了PSC，siHIF-1α、siHIF-2α的PAC經(jīng)缺氧處理后的CM刺激PSC，細胞的激活和遷移都受到了抑制。

圖6 缺氧誘導的HIF-1α和HIF-2α促進了SPHK1轉錄以及PSC的激活

PAC和PSC的體外實驗初步證明了SPHK1/S1P/S1PR2信號傳導在PSC的激活中發(fā)揮作用。在動物體內(nèi)，PF-543和JTE-013治療均能顯著抑制CP小鼠胰腺纖維化、血管生成和炎癥相關基因的表達，改善胰腺外分泌功能，緩解CP小鼠的發(fā)病，說明抑制SPHK1/S1P/S1PR2信號傳導可顯著減輕CP小鼠的胰腺纖維化。

圖7 抑制SPHK1/S1P/S1PR2信號通路可減輕CP小鼠的發(fā)病機制和纖維化

綜上所述，PACs中SPHK1催化SPH生成S1P，S1P通過S1PR2釋放并活化PSCs?；罨腜SCs分泌大量ECM，促進胰腺纖維化和局部缺氧，從而加重PACs損傷。SPHK1/S1P通路為未來的治療提供潛在的靶點，SPHK1和S1PR2抑制劑在本實驗的應用也為臨床治療CP提供新思路。