如果選擇的方法不對，或者細(xì)胞株不對，不同的細(xì)胞株做基因敲除細(xì)胞系的改造會有什么變化呢？篩選細(xì)胞是基因敲除細(xì)胞成敗的重要環(huán)節(jié)！如果沒有正確的方法那么基因敲除的細(xì)胞株工作就不能順利的進(jìn)行，首先要知道影響基因敲除細(xì)胞系的主要關(guān)鍵點是什么？其次是要了解和熟悉具體的實驗流程和實驗步驟，讓自己輕松的完成基因敲除細(xì)胞株的構(gòu)建流程。

一. 如何選擇基因敲除的細(xì)胞：

1.關(guān)鍵點：支原體污染在絕大部分的實驗室里都不太被重視，如果支原體污染了細(xì)胞，則會導(dǎo)致細(xì)胞產(chǎn)生很多問題：如細(xì)胞的增殖問題，同時還會影響細(xì)胞的代謝，產(chǎn)生的數(shù)據(jù)也會有很大的誤差，所以在實驗室里的技術(shù)人員都需要非常重視。

2.檢測方法有兩種：細(xì)胞培養(yǎng)和PCR鑒定。

3.基因敲除的優(yōu)勢：克隆形成率高，敲除效率高，細(xì)胞容易增殖，但是有一個例外就算是做了細(xì)胞基因敲除株的構(gòu)建，也無法獲得基因敲除的單克隆細(xì)胞，那就是沒有多基因的問題；染色體不突變；難增殖的細(xì)胞；細(xì)胞的數(shù)量有限；做基因敲除細(xì)胞株難以得到純合子敲除的細(xì)胞系的原因就是克隆的拷貝數(shù)太多。

4具體原因：只能是腫瘤細(xì)胞系，不能是永生細(xì)胞系，往往很多永生細(xì)胞系做起來都比較有挑戰(zhàn)性，當(dāng)在做基因敲除細(xì)胞株時，如果敲除效率是x，則拷貝數(shù)是n，那么純合敲除的效率就是：x^n，可見效果就不顯著了。

二. 基因敲除細(xì)胞系的敲除方法：

1.建議首選：如果只是做常規(guī)的移碼敲除，那么一個細(xì)胞里面只有2個基因位點，是很難保證兩個基因位點是一樣的移碼，所以得到移碼的數(shù)據(jù)也不同，當(dāng)你在鑒定測序看圖的時候就沒有那么清晰，所以，選擇片段敲除是一個較為有效的辦法。

2.關(guān)鍵點：移碼敲除在很多時候并不徹底，會在后續(xù)的實驗中出現(xiàn)Western Blot的問題，出現(xiàn)神秘的條帶，大片段的基因敲除是幾kb的缺失，mRNA就沒有目的蛋白的轉(zhuǎn)錄，Western Blot問題也解決了，鑒定敲除方法：純合敲除細(xì)胞系，比移碼敲除效率更高。

3.如何判斷是大片段敲除的細(xì)胞系：主要是通過目的基因片段對PCR擴(kuò)增的方式判斷。

三. 細(xì)胞周期分析：

1.如果采用病毒法，構(gòu)建載體，病毒包裝，轉(zhuǎn)染細(xì)胞，細(xì)胞篩選，單克隆，PCR鑒定/測序，擴(kuò)增——一個步驟都不能少。

2.使用轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)，構(gòu)建好敲除質(zhì)粒后，直接用質(zhì)粒電轉(zhuǎn)到細(xì)胞。

3.做基因敲除細(xì)胞株時，不要選擇增殖太慢的，如果過表達(dá)量的Cas9蛋白+gRNA快速靶向，最快只需要5周時間，7-12周就可以得到純合子細(xì)胞。

四.細(xì)胞拿到怎樣用：

如果是單克隆的細(xì)胞需要大量擴(kuò)增，完全不用擔(dān)心培養(yǎng)過程中蛋白恢復(fù)的問題，所有的細(xì)胞都必須經(jīng)過嚴(yán)格測試，保證安全無污染，低內(nèi)毒素可以直接用于動物體內(nèi)實驗，做代謝分析也能更加安心。如果移碼突變，大量擴(kuò)增可能會出現(xiàn)恢復(fù)（特別是敲除的蛋白對細(xì)胞增殖有優(yōu)勢的情況）細(xì)胞動物實驗和代謝研究更放心。?

五．誘導(dǎo)系統(tǒng)：

外源蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)/沉默能很好比較本底和干預(yù)的區(qū)別，非常有力的詮釋目的基因/蛋白的作用機(jī)理，特別適合研究自身具有毒性的蛋白，現(xiàn)已經(jīng)被廣泛使用。

Cas9x海星生物提供可誘導(dǎo)蛋白表達(dá)/基因敲除細(xì)胞株構(gòu)建服務(wù)借助于真核表達(dá)載體/慢病毒系統(tǒng)，構(gòu)建含有“開關(guān)”控制表達(dá)/沉默目的基因的質(zhì)粒/病毒，通過電轉(zhuǎn)/感染在各種細(xì)胞基因組上整合載體，利用抗生素篩選，得到可誘導(dǎo)的穩(wěn)定細(xì)胞株，經(jīng)過32代的穩(wěn)定性QC檢測，完成基因敲除細(xì)胞株的構(gòu)建工作。

主要包含如下步驟:

1.?載體構(gòu)建（誘導(dǎo)質(zhì)粒載體、病毒載體）；

2.?轉(zhuǎn)染；感染；電轉(zhuǎn)；

3.?“開關(guān)”誘導(dǎo)下目的蛋白初步檢測；

4.?抗生素篩選；

5.?“開關(guān)”目的蛋白再次檢測（定性/半定量）；

6.?單克隆細(xì)胞株穩(wěn)定性檢測。

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