Chromosome walking? ?染色體步移技術

Walking使用目的：用于獲得與已知序列相鄰的未知序列。

Walking應用方面：

1.鑒定T-DNA或轉(zhuǎn)座子的插入位點，鑒定轉(zhuǎn)基因技術所導致的外源基因的插入位點

2.根據(jù)基因的已知片段，EST或插入的轉(zhuǎn)座子序列克隆目的基因，分離基因的啟動子及調(diào)控元件

注：EST（expressed sequence tags）：表達序列標簽。指不同組織來源的cDNA序列。

EST是從已建好的cDNA庫中隨機取出一個克隆，從5‘末端或3’末端對插入的cDNA片段進行一輪單向自動測序，所獲得的約60-500bp的一段cDNA序列。

3.用于人工染色體PAC、YAC、和BAC的片段搭接

注：人工染色體，?artificial chromosome?（天然染色體基本功能包括復制起始點、著絲粒和端粒。人們?yōu)榱丝寺〈笃蜠NA，利用DNA體外重組技術分離了天然染色體的基本功能元件并將它們連接起來，從而構成人工染色體）

PAC，Bacteriophage P1 vectors? ，P1派生人工染色體。? ?P1噬菌體載體是在P1噬菌體的基礎上構建的克隆載體，用于克隆真核基因組DNA。

YAC， Yeast artificial chromosomes,YACs，酵母人工染色體。YAC是人工染色體中能克隆最大DNA片段的載體，可以插入100-2000kb的外源DNA片段。

BAC，Bacterial? artificial chromosomes,BACs,細菌人工染色體?,細菌克隆載體。

4.構建圖位克隆中的重疊群? ?

5.轉(zhuǎn)化標記輔助育種中的STS或SCAR標記等

注：STS?，Sequence Tagged Sites，序列標記位點，是以特定引物對序列進行擴增的一類分子標記。

SCAR，Sequence-characterized Amplified Region，序列特異性擴增區(qū)。

總之，Walking用于獲得與已知序列相鄰的未知序列。

技術原理：根據(jù)已知基因組DNA序列分別設計三條同向且退火溫度較高的特異性引物（SP，Specific? Primer），與 Walking試劑盒中提供的四種經(jīng)過特別設計的退火溫度較低的簡并引物，即AP1 、AP2、AP3 、AP4進行熱不對稱PCR反應。

注：AP? ,arbitrarily primer 隨機引物，非特異性引物

Tail-PCR， thermal asymmertric interlaced PCR?，交錯熱不對稱PCR。

• 通常情況下，其中至少有一種簡并引物可以與特異性引物之間利用退火溫度的差異進行熱不對稱PCR反應，通過三次巢式PCR反應即可獲取已知序列的側(cè)翼序列。

• 如果一次實驗獲取的長度不能滿足實驗要求時，還可以根據(jù)第一次步移獲取的序列信息，繼續(xù)進行側(cè)翼序列獲取。

注：Arbitrary degenerate prime ,AP，隨機簡并引物

（TaKaRa）以簡并引物AP1為例：