近期發(fā)現(xiàn)一個(gè)有趣的現(xiàn)象，很多老師秉承著一個(gè)觀念，就是敲除實(shí)驗(yàn)里的細(xì)胞沒必要做到單克隆，只要蛋白水平有敲低效果就可以完成實(shí)驗(yàn)。

聽起來這的確是個(gè)省時(shí)省力的好方法，但是細(xì)細(xì)琢磨下來又似乎存在著一些弊端。要知道，這個(gè)方法的可行性建立在100%確保最終細(xì)胞會(huì)有敲低效果的基礎(chǔ)上，只是結(jié)果會(huì)呈現(xiàn)出或多或少的差異。而實(shí)際上，這一太過理想化的構(gòu)思卻會(huì)面臨諸多現(xiàn)實(shí)問題，下面將用實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)為您一一分析。

就算是同株來源，我和你也不一樣

F老師想用一株自有細(xì)胞系做敲除株，最終鑒定敲除株目的蛋白的敲低效果?？紤]到細(xì)胞可能存在異質(zhì)化，在進(jìn)行敲除實(shí)驗(yàn)之前我們對(duì)該野生型細(xì)胞株先進(jìn)行了單克隆化處理，并隨機(jī)篩選了10株單克隆進(jìn)行RT-qPCR驗(yàn)證。

結(jié)果表明，不同單克隆的目的基因其表達(dá)水平相差很大，最高的表達(dá)效率是原始細(xì)胞株的近10倍，而最低的則是原始株的3.50%，兩者之間的表達(dá)效率相差將近300倍。

“死灰復(fù)燃”的蛋白表達(dá)

M老師與F老師有著大致相同的敲除實(shí)驗(yàn)方案和實(shí)驗(yàn)訴求，不同的是，M老師并沒有打算做到單克隆這一步。轉(zhuǎn)染藥篩細(xì)胞后，他用野生型與Mixclone進(jìn)行了RT-qPCR驗(yàn)證，結(jié)果顯示有明顯的表達(dá)量降低。

M老師認(rèn)為，該結(jié)果也可以在WesternBlot中完美呈現(xiàn)，但事與愿違，幾乎沒有任何敲低效果。經(jīng)建議M老師同意進(jìn)一步單克隆化，經(jīng)過篩選，最終獲得了一株敲低效果顯著的單克隆敲除株。

“穩(wěn)定+高效”才是魚和熊掌兼可得

讀到此處的你或許會(huì)說，我當(dāng)然也知道單克隆細(xì)胞株的優(yōu)勢(shì)，也希望能一次性獲得好幾株單克隆細(xì)胞株，讓我篩選效果最佳的。

可是單克隆化的過程總是會(huì)遇到諸多困難，就只能放棄了，聽別人說單克隆化沒必要，只要細(xì)胞株在蛋白水平有敲低效果就行，我也照著做好了。然而大量的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)證明，不如意的結(jié)果，往往可能就是因?yàn)檫@一點(diǎn)“沒必要”造成的。

高效地實(shí)現(xiàn)單克隆化

傳統(tǒng)的單克隆化方法，主要有極限稀釋法和克隆環(huán)法：

極限稀釋法是通過細(xì)胞計(jì)數(shù)將細(xì)胞稀釋至極限，以單個(gè)細(xì)胞的方式接種至96孔板中培養(yǎng)獲得克隆的方式；然而這種方法培養(yǎng)周期長(zhǎng)，會(huì)消耗大量耗材和試劑成本，結(jié)果往往也不盡如人意，如獲得的克隆樣本數(shù)不多，邊緣效應(yīng)導(dǎo)致細(xì)胞死亡等。

克隆環(huán)法是將數(shù)以百計(jì)的細(xì)胞接種于培養(yǎng)器皿中培養(yǎng)2周，單個(gè)細(xì)胞會(huì)在局域增殖形成克隆集落，使用克隆環(huán)對(duì)集落進(jìn)行標(biāo)定，消化并接種至96孔板中。這種方式培養(yǎng)周期也較長(zhǎng)，并且要求實(shí)驗(yàn)人員有很強(qiáng)的無菌操作技能。

ClonePlus技術(shù)

我們從傳統(tǒng)方法中不斷吸取經(jīng)驗(yàn)摒棄不足，Cas9X海星生物技術(shù)平臺(tái)研發(fā)出了ClonePlus技術(shù)。該技術(shù)是專有高效的細(xì)胞敲除技術(shù)，主要通過高通量電轉(zhuǎn)系統(tǒng)和高通量的克隆分選技術(shù)結(jié)合，獲得基因編輯的單細(xì)胞，其克隆形成率可以達(dá)98%，就算是克隆形成率低的細(xì)胞株也能獲得敲除單克隆，7-10天可以完成絕大部分的細(xì)胞的單克隆工作。

基因組穩(wěn)定的單克隆化細(xì)胞株，通過篩選獲得的高效表達(dá)，“穩(wěn)定+高效”，魚和熊掌兼可得。Cas9X技術(shù)團(tuán)隊(duì)致力于將實(shí)驗(yàn)中的每個(gè)細(xì)節(jié)都做到極致，力求精準(zhǔn)而不是做無用功，讓您的每分耕耘皆有收獲。

作者：海星生物 公眾號(hào)：Cas9X細(xì)胞基因編輯

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