NETosis是一種新的細(xì)胞死亡形式，以死亡中性粒細(xì)胞釋放DNA染色質(zhì)為特征。雖然它有助于微生物防御，但可能會加劇自身免疫性疾病中的炎癥，導(dǎo)致組織損傷。NETosis對抗中性粒細(xì)胞胞漿抗體相關(guān)的腎小球腎炎（ANCA-GN）的影響尚未被探索，需要進一步調(diào)查。

圖1 研究流程圖

1. 共表達網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和關(guān)鍵模塊識別

篩選出ANCA-GN中的差異表達基因。首先，在校正批次效應(yīng)后，將兩個數(shù)據(jù)集GSE108109和GSE104948合并為一個單一隊列進行進一步分析。接下來，使用WGCNA分析在ANCA-GN中尋找共表達基因模塊。在排除平均表達量小于1的基因并保留方差最大的25%基因后，對27個對照樣本和37個AAV樣本進行聚類。為了與無標(biāo)度網(wǎng)絡(luò)一致，選擇了β = 9的軟閾值（圖2A）。使用聚類高度閾值0.25合并強相關(guān)的模塊，并顯示在聚類樹下方（圖2B）。鑒定出與ANCA-GN相關(guān)的三個模塊（圖2C）。為了過濾出與NETosis最相關(guān)的模塊，將這三個模塊的基因與已報道的NETs基因集進行交集運算，Wayne圖顯示黃色模塊與NETs的交集最多（圖2E）。通過計算模塊與臨床特征之間的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)黃色模塊與ANCA-GN組之間存在顯著正相關(guān)（r=0.79，p=3e-12）。此外，在黃色模塊的散點圖中還發(fā)現(xiàn)GS與MM之間存在顯著相關(guān)性（圖2D）。因此，黃色模塊被確定為與ANCA-GN相關(guān)的最相關(guān)模塊。從圖2F可以看出，ANCA-GN組與對照組之間的SIGLEC5表達沒有差異，最終納入研究的有18個DE-NETs。

圖2 WGCNA模塊的構(gòu)建

2. DE-NETs的功能分析

為了闡明DE-NETs在ANCA-GN中的潛在生物學(xué)意義，進行了GO富集分析和KEGG富集分析。在GO富集分析中，主要富集了“白細(xì)胞介素-6產(chǎn)生的正調(diào)節(jié)”、“細(xì)胞因子產(chǎn)生的正調(diào)節(jié)”和“白細(xì)胞介素-8產(chǎn)生的正調(diào)節(jié)”等生物過程（BP），主要富集了“分泌顆粒膜”、“三級顆?！焙汀案缓琭icolin-1的顆?！钡燃?xì)胞組成（CC），而“水解酶活性，作用于糖基鍵”、“模式識別受體活性”和“NAD+核苷酸酶活性”等主要富集了分子功能（MF）（圖3A）。在KEGG富集分析中，主要富集了“中性粒細(xì)胞外細(xì)胞陷阱形成”、“Toll樣受體信號通路”和“金黃色葡萄球菌感染”（圖3B），這表明炎癥因子產(chǎn)生和Toll樣受體信號通路可能參與了ANCA-GN中NETosis的形成。

圖3 DE-NETs的功能分析

3. NETosisScore模型的構(gòu)建和驗證

為了確認(rèn)ANCA-GN中NETosis的表達模式，作者將來自兩個ANCA-GN隊列（GSE104948和GSE108109）的64名患者納入元隊列作為進一步分析的訓(xùn)練集。基于18DE-NETs的中位數(shù)ssGSEA得分，構(gòu)建了一個NETosis Score模型（NETosisScore），并將64名患者分為高風(fēng)險組和低風(fēng)險組（圖4A）。通過主成分分析（PCA），可以清楚地區(qū)分高風(fēng)險組和低風(fēng)險組之間的分布（圖4B）。從兩組的NETosisScore分布圖可以看出，隨著風(fēng)險評分的增加，高風(fēng)險組的患者數(shù)量逐漸增加（圖4C）。同時，所有的DE-NETs在高風(fēng)險組和低風(fēng)險組之間都有顯著差異表達（圖4D）。訓(xùn)練集和兩個獨立的驗證集（E-MTAB-1994和GSE104954）被納入以研究NETosisScore模型在區(qū)分ANCA-GN患者和對照組方面的能力。在訓(xùn)練集中，如箱線圖所示，NETosisScore能夠顯著區(qū)分正常對照組和ANCA-GN患者（p=2）。NETosisScore在ANCA-GN患者中顯著高于正常對照組（圖4E）；訓(xùn)練集中NETosisScore的ROC曲線下面積為0.920（p<0.001）（圖4H）。此外，獨立數(shù)據(jù)集驗證了NETosisScore模型的區(qū)分能力。不僅在E-MTAB-1994數(shù)據(jù)集（p=0.003）（圖4F）和GSE104954數(shù)據(jù)集（p=0.00017）（圖4G）中，ANCA-GN組的NETosisScore顯著高于對照組，而且在E-MTAB-1994數(shù)據(jù)集中ROC曲線的面積為0.797（p<0.001）（圖4I），在GSE104954數(shù)據(jù)集中為0.825（p<0.001）（圖4J），這表明NETosisScore模型具有很強的診斷能力，而且ANCA-GN患者可能具有不同的NETosis表達模式。

圖4 在ANCA-GN中構(gòu)建和驗證NETosisScore模型

4. 兩個NETosisScore亞型的免疫特征和生物通路

為了進一步確定高風(fēng)險組和低風(fēng)險組之間的免疫特征，作者使用CIBERSORT算法比較了兩組之間的免疫細(xì)胞浸潤豐度。結(jié)果顯示，與低風(fēng)險組相比，高風(fēng)險組的免疫細(xì)胞浸潤豐度更高。值得注意的是，激活的CD4 T細(xì)胞、中央CD4記憶T細(xì)胞和效應(yīng)CD4記憶T細(xì)胞在兩個亞組中表達差異顯著，高風(fēng)險組的水平更高（圖5A）。此外，網(wǎng)絡(luò)熱圖還顯示NETosisScore與幾種CD4 T細(xì)胞呈正相關(guān)（圖5B）。這些數(shù)據(jù)表明，在NETosisScore模型中，CD4 T細(xì)胞與高風(fēng)險組密切相關(guān)，并可能在ANCA-GN的發(fā)展中發(fā)揮重要作用。對CD4 T細(xì)胞亞群的進一步分析表明，在高風(fēng)險NETosisScore組中，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞與之相關(guān)性最強，相關(guān)系數(shù)最高（圖5C）。盡管也觀察到Th17、Th2和Th1細(xì)胞，但與高風(fēng)險組最強的關(guān)聯(lián)出現(xiàn)在Treg細(xì)胞中。總之，研究結(jié)果表明，在ANCA-GN中，Treg細(xì)胞可能在高風(fēng)險NETosisScore組中發(fā)揮關(guān)鍵作用。這支持了Treg細(xì)胞招募巨噬細(xì)胞到腎小球的觀點，可能對疾病進展產(chǎn)生重要影響。

圖5 NETosisScore亞型的免疫特征和功能富集分析

此外，為了闡明高風(fēng)險組和低風(fēng)險組之間的潛在生物學(xué)功能，作者使用GSEA富集分析來探索不同亞組之間的生物過程。在高風(fēng)險組中，主要涉及細(xì)胞對生物刺激的反應(yīng)、白細(xì)胞遷移和吞噬作用（圖5D），而在低風(fēng)險組中，主要涉及α氨基酸代謝、單羧酸降解和有機酸降解（圖5E），這表明高風(fēng)險組可能與免疫有關(guān)，而低風(fēng)險組可能與物質(zhì)代謝有關(guān)。為了驗證這個推測，作者使用GSVA分析來研究不同亞組之間的生物通路。KEGG富集分析的熱圖顯示，高風(fēng)險組中富集了B細(xì)胞受體信號通路、細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用、Toll樣受體信號通路和NOD樣受體信號通路，而低風(fēng)險組中則更集中于賴氨酸降解、組氨酸代謝和脂肪酸代謝等其他通路（圖5F）。值得注意的是，低風(fēng)險組在代謝相關(guān)通路上富集程度較高，而高風(fēng)險組主要富集于免疫相關(guān)通路，這與GSEA富集分析的結(jié)果一致，并證實了上述猜測。以上結(jié)果表明，NETosisScore模型能更好地區(qū)分ANCA-GN的免疫微環(huán)境的異質(zhì)性，高風(fēng)險組可能通過免疫相關(guān)通路促進ANCA-GN的發(fā)展。

5. NETosis相關(guān)基因的鑒定

為了在ANCA-GN中確定與NETosis相關(guān)的基因（NRGs），使用了一系列的生物信息學(xué)算法。為了排除不重要的基因，使用了三種機器學(xué)習(xí)方法來選擇ANCA-GN中的重要基因。首先，使用SVM-RFE算法基于18個DE-NETs篩選出了八個基因（圖6A，B）。接下來，應(yīng)用了隨機森林樹算法來識別出七個基因（圖6C，D），而Lasso回歸則確定了10個NRGs（圖6E，F(xiàn)）。隨后，將三種機器學(xué)習(xí)算法的結(jié)果進行交叉，并確定了最終的六個顯著基因作為ANCA-GN的潛在生物標(biāo)志物（CYBB，ITGB2，ITGAM，TLR2，TLR7和LILRB2）（圖6G）。

圖6 NET相關(guān)基因（NRGs）的鑒定

6. NRGs的免疫特性和相互作用功能分析

為了進一步探索ANCA-GN的免疫特征，作者采用了ssGSEA算法來預(yù)測ANCA-GN組和對照組之間的免疫細(xì)胞浸潤和免疫反應(yīng)的差異。由于ANCA-GN組和對照組中嗜酸性粒細(xì)胞的統(tǒng)計學(xué)顯著性差異不大，因此作者排除了嗜酸性粒細(xì)胞，總共使用了28種免疫細(xì)胞浸潤或免疫反應(yīng)來探索ANCA-GN組和對照組之間的免疫特征差異（圖7A）。結(jié)果顯示，與健康對照組相比，ANCA-GN組的CCR、巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞抑制和TIL水平顯著升高（圖7B）。這些發(fā)現(xiàn)表明，這些免疫細(xì)胞和免疫反應(yīng)在ANCA-GN的進展中起著關(guān)鍵作用。此外，作者進一步探索了六個NRG與28種免疫細(xì)胞或免疫反應(yīng)之間的關(guān)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)CCR與CYBB（r=0.922；p<0.001）、ITGB2（r=0.917；p<0.001）、ITGAM（r=0.887；p<0.001）、TLR2（r=0.836；p<0.001）、TLR7（r=0.883；p<0.001）和LILRB2（r=0.906；p<0.001）之間存在強烈的正相關(guān)關(guān)系。巨噬細(xì)胞與CYBB（r=0.886；p < 0.001）、ITGB2（r = 0.913；p < 0.001）、ITGAM（r = 0.862；p < 0.001）、TLR2（r = 0.852；p< 0.001）和TLR7（r = 0.851；p<0.001）呈正相關(guān)。T細(xì)胞共抑制也與CYBB（r=0.841；p < 0.001）、ITGB2（r = 0.866；p < 0.001）、ITGAM（r = 0.824；p < 0.001）、TLR7（r = 0.822；p < 0.001）和LILRB2（r = 0.836；p<0.001）呈正相關(guān)。腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞（TIL）與CYBB（r=0.889；p < 0.001）、ITGB2（r = 0.878；p< 0.001）、ITGAM（r = 0.848；p < 0.001）、TLR7（r = 0.823；p < 0.001）和LILRB2（r = 0.888；p<0.001）呈正相關(guān)。而抗原呈遞細(xì)胞共抑制與TLR2（r=-0.264；p=0.034）呈負(fù)相關(guān)，B細(xì)胞也與ITGB2（r = -0.286, p = 0.021）、ITGAM（r = -0.360, p = 0.003）、TLR2（r = -0.367, p = 0.002）和TLR7（r = -0.259, p = 0.038）呈負(fù)相關(guān)。

作者的研究結(jié)果顯示，NRGs與巨噬細(xì)胞之間存在強烈關(guān)聯(lián)，而先前的研究表明巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞都參與了NETosis過程。巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞對炎癥和組織損傷起到貢獻作用，而中性粒細(xì)胞是NETs形成的核心，促進炎癥、內(nèi)皮損傷和血栓形成。為了進一步闡明ANCA-GN樣本中NRGs與單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞之間的關(guān)系，作者采用了四種算法來評估免疫細(xì)胞浸潤的豐度：CIBERSORT、xCell、MCPCounter和quanTIseq。與NETosis相關(guān)的基因主要包括CYBB、ITGAM、ITGB2、TLR2、TLR7和LILRB2。隨后，作者使用熱圖可視化了免疫細(xì)胞浸潤與NRGs之間的關(guān)系。在所有四種免疫細(xì)胞浸潤算法中，巨噬細(xì)胞與NRGs之間存在顯著的相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)最高。單核細(xì)胞在CIBERSORT和xCell算法中與NRGs呈正相關(guān)，但在MCPCounter算法和quanTIseq算法中缺乏顯著的相關(guān)性。中性粒細(xì)胞與NRGs之間的相關(guān)性微乎其微。總之，作者的研究結(jié)果顯示，在ANCA-GN中，巨噬細(xì)胞與NRGs的關(guān)聯(lián)比單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞更強。這些結(jié)果表明，在ANCA-GN的進展過程中，這6個NRGs可能通過巨噬細(xì)胞釋放NETs。需要進一步研究來全面了解這些關(guān)系的復(fù)雜性以及對ANCA-GN治療的影響。

圖7

當(dāng)作者深入研究NRGs的相關(guān)性和潛在功能時，相關(guān)性熱圖顯示了六個NRGs之間的強烈正相關(guān)，相關(guān)值大于0.7，表明這些基因之間存在顯著的功能相似性。為了進一步了解NRGs之間的關(guān)系，作者使用GeneMANIA數(shù)據(jù)庫構(gòu)建了一個蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)（圖7C）。通過GO/KEGG富集分析了26個相關(guān)基因。富集的生物過程（BP）包括調(diào)節(jié)白細(xì)胞介素-8的產(chǎn)生、調(diào)節(jié)白細(xì)胞介素-6的產(chǎn)生以及對生物刺激的細(xì)胞響應(yīng)。富集程度最高的細(xì)胞組分（CC）包括分泌顆粒膜、質(zhì)膜的整體組分和三級顆粒。分子功能（MF）類別富集了肽結(jié)合、正調(diào)控DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性以及以氧為受體的NAD(P)H氧化還原酶活性（圖7D）。KEGG分析顯示，主要富集在Toll樣受體信號通路、模式識別受體信號通路和NIK/NF-kappaB信號通路（圖7E）。通過比較DE-NETs和NRGs的功能富集通路，作者發(fā)現(xiàn)Toll樣受體信號通路在兩者中都顯著富集。

為了深入了解ANCA-GN的分子機制，作者將重點研究Toll樣受體信號通路。通過使用KEGG路徑視圖，作者發(fā)現(xiàn)TLR2在這一過程中起著核心作用。通過與肽聚糖（G+）脂蛋白和酶聚糖的相互作用，TLR2通過P13K-AKt信號通路與下游的NF-kappaB結(jié)合，促進了IL-1B和IL-6等促炎因子的合成，從而加劇了ANCA-GN的進展。此外，作者還發(fā)現(xiàn)TLR2在中性粒細(xì)胞外陷阱的形成中起著關(guān)鍵作用。在HMGB1的影響下，氧化低密度脂蛋白、金黃色葡萄球菌和RSVF蛋白與TLR2結(jié)合，激活Toll樣受體信號通路，導(dǎo)致下游組蛋白乙?；?，最終導(dǎo)致組蛋白解壓縮和轉(zhuǎn)錄激活。這最終導(dǎo)致NETosis以及對病原體的捕獲和消除，同時也引發(fā)血栓形成和凝血功能障礙、自身免疫和補體激活。這些發(fā)現(xiàn)強調(diào)了TLR2在ANCA-GN中的潛在核心作用以及其作為干預(yù)靶點的可行性。先前的研究表明，在AAV患者的腎臟中，TLR2和TLR4的表達失調(diào)，與越來越多的證據(jù)一致，表明Toll樣受體（TLRs）與AAV中的免疫反應(yīng)之間存在密切關(guān)系。在AAV患者的腎小球中，與健康對照組相比，TLR2和TLR4的表達顯著升高。此外，發(fā)現(xiàn)TLR4在腎小球內(nèi)皮細(xì)胞上表達，并與初始血清肌酐水平、總新月體比例和細(xì)胞新月體在腎臟標(biāo)本中呈負(fù)相關(guān)，突顯了TLR4在ANCA-GN中的關(guān)鍵作用。

作者的研究發(fā)現(xiàn)，在ANCA-GN患者中，TLR4的表達上調(diào)，與正常對照組相比有顯著差異。TLR4的ROC曲線下面積為0.748，顯示出相當(dāng)大的診斷潛力。主要受影響的通路包括膽酸代謝的下調(diào)和有絲分裂紡錘體、IL6-JAK-STAT3信號通路、炎癥反應(yīng)和PI3K-AKT-mTOR信號通路的上調(diào)。免疫細(xì)胞浸潤分析顯示，TLR-4與巨噬細(xì)胞和Th1細(xì)胞呈顯著正相關(guān)，與未成熟樹突狀細(xì)胞呈顯著負(fù)相關(guān)。此外，TLR4與血清肌酐（Scr）呈顯著正相關(guān)，與估計腎小球濾過率（eGFR）呈顯著負(fù)相關(guān)?？傊?，TLR4在ANCA-GN中似乎發(fā)揮著關(guān)鍵作用，因為它在該病情中上調(diào)，并具有顯著的診斷能力。這種分子參與了幾個關(guān)鍵途徑，并與特定的免疫細(xì)胞浸潤以及腎功能相關(guān)。這些發(fā)現(xiàn)表明TLR4可能是ANCA-GN的重要治療靶點和預(yù)后生物標(biāo)志物。

7. 構(gòu)建諾莫圖并分析臨床腎功能

為了探索NRGs在臨床實踐中的作用，分別探討了NRGs的臨床診斷效能及其與腎功能的關(guān)系。首先，基于訓(xùn)練集（GSE104948和GSE108109）中6個NRGs（CYBB、ITGB2、ITGAM、TLR2、TLR7和LILRB2）的表達水平，利用R語言中的“rms”包構(gòu)建了ANCA-GN的臨床診斷模型（圖8A）。然后，通過校準(zhǔn)曲線分析、決策曲線分析（DCA）和受試者工作特征（ROC）曲線分析評估了該模型的診斷效能。在訓(xùn)練集中，校準(zhǔn)曲線顯示實際ANCA-GN風(fēng)險與預(yù)測風(fēng)險之間的最小差異，突出了該模型在預(yù)測ANCA-GN方面的實用性（圖8B）。DCA顯示，當(dāng)DCA曲線的高風(fēng)險閾值為0-1時，該模型明顯優(yōu)于其他單個NRGs，表明該模型在預(yù)測ANCA-GN的決策效益方面明顯優(yōu)于其他單個NRGs，并且患者可以從該模型中受益（圖8C）。此外，ROC曲線顯示模型的曲線下面積（AUC）約為0.984，高于任何其他單基因的AUC，表明該模型具有較高的診斷效率（圖8D）。獨立數(shù)據(jù)集（GSE108112）用于驗證該模型的診斷效能。顯然，校準(zhǔn)曲線、DCA曲線分析和ROC曲線的AUC結(jié)果與訓(xùn)練數(shù)據(jù)集一致（圖8E-G）。因此，基于NRGs的臨床診斷模型具有較強的診斷效能，并可為預(yù)測ANCA-GN的發(fā)生提供有效參考。

圖8 構(gòu)建測量臨床腎功能的圖表并進行分析

隨后，進一步分析了NRGs與臨床腎功能之間的相關(guān)性。從Nephroseq數(shù)據(jù)庫V5中下載了6個NRGs的表達水平、校正腎小球濾過率（GFR）和血清肌酐（Scr）。Spearman相關(guān)分析顯示，6個NRGs的表達水平隨腎功能下降而增加，并且所有NRGs與GFR呈正相關(guān)。其中，TLR2與GFR之間的相關(guān)性最強（r = 0.64，p = 2.4e-8）（圖8H）。此外，所有6個NRGs與Scr水平呈負(fù)相關(guān)（圖8I），表明NRGs可以預(yù)測ANCA-GN的腎損傷嚴(yán)重程度，并可能參與ANCA-GN的腎損傷進展。這些發(fā)現(xiàn)表明，NRGs可能作為ANCA-GN預(yù)后的潛在生物標(biāo)志物。

8. NRGs的獨立數(shù)據(jù)集驗證

說到作為疾病生物標(biāo)志物，僅僅在健康組和對照組之間具有差異表達是不夠的。這些標(biāo)志物還必須在診斷方面具有高度的有效性。為了評估這六個NRGs在這方面的適用性，作者進行了分析。作者從訓(xùn)練數(shù)據(jù)集中的發(fā)現(xiàn)表明，這六個NRGs在ANCA-GN組和正常對照組之間的表達差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（p<0.001），ANCA-GN組的表達水平升高（補充圖6A）。獨立驗證研究的結(jié)果進一步支持了這些觀察結(jié)果，在GSE104954（p<0.001）（圖9A）和E-MTAB-1944（p<0.001）（圖9B）中檢測到了這六個NRGs的差異表達。此外，所有的NRGs在ANCA-GN組中的表達都比對照組高。總之，這六個NRGs滿足ANCA-GN組和正常對照組之間差異表達的標(biāo)準(zhǔn)，使它們成為潛在的ANCA-GN生物標(biāo)志物。

圖9 獨立數(shù)據(jù)集驗證NRGs

接下來，進一步研究了6個NRG在ANCA-GN和正常樣本中的診斷價值。在訓(xùn)練數(shù)據(jù)集中，所有NRG都顯示出很高的診斷準(zhǔn)確性，這表現(xiàn)在受試者工作特征曲線（ROC曲線）下的面積（AUC）上，所有的AUC都大于0.90。這些NRG包括CYBB（AUC：0.975）、ITGB2（AUC：0.968）、ITGAM（AUC：0.946）、TLR2（AUC：0.920）、TLR7（AUC：0.918）和LILRB2（AUC：0.913）。這一趨勢在獨立驗證集E-MTAB-1944中得到了證實，其中CYBB的AUC為0.989，其次是ITGB2（AUC：0.969）、ITGAM（AUC：0.983）、TLR2（AUC：0.83）、TLR7（AUC：0.953）和LILRB2（AUC：0.908）（圖9C-H）。這些發(fā)現(xiàn)得到了來自獨立數(shù)據(jù)集GSE104954的結(jié)果的進一步支持。這些結(jié)果表明，NRG作為ANCA-GN的生物標(biāo)志物具有很強的潛力，因為它們在區(qū)分ANCA-GN和健康樣本方面表現(xiàn)出優(yōu)異的診斷性能。

9. qPCR和免疫組化染色

為了將NRGs的潛在價值轉(zhuǎn)化到臨床環(huán)境中，作者確定了ANCA-GN患者和健康對照組之間6個NRGs的差異表達水平。作者收集了臨床診斷為ANCA-GN的患者和與其年齡和性別匹配的健康個體的全血樣本，并使用qPCR定量測定了6個NRGs的表達水平。qPCR結(jié)果顯示，除了ITGB2外，所有的NRGs在ANCA-GN患者中的表達水平均顯著高于健康對照組，并且在ANCA-GN組和健康組之間的表達水平在統(tǒng)計學(xué)上具有顯著差異（p<0.01）（圖10A-F）。這種對6個NRGs mRNA表達的人類水平驗證與訓(xùn)練數(shù)據(jù)集和獨立驗證集的結(jié)果一致，表明NRGs可能作為ANCA-GN進展的潛在標(biāo)志物。

圖10 NRGs的qPCR和免疫組化染色驗證

隨后，作者嘗試對ANCA-GN患者和年齡性別匹配的ccRCC患者的腎臟切片以及相鄰非腫瘤組織進行NRGs（CYBB，ITGB2，ITGAM，LILRB2，TLR2和TLR7）的免疫組化（IHC）染色。IHC染色結(jié)果顯示，CYBB在ANCA-GN中呈中度陽性（得分=2+），主要分布在腎小球內(nèi)皮細(xì)胞和腎小管上皮細(xì)胞中。有趣的是，盡管ITGB2在qPCR中沒有顯示出顯著的差異表達，但在ANCA-GN中呈中度陽性（得分=2+）。這種差異可能是由于樣本量較小，無法完全反映實際差異，需要使用更多樣本進行驗證。相反，IHC染色可以觀察到細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的定位，可能富集在炎癥區(qū)域的腎小球和腎小管內(nèi)皮細(xì)胞表面，導(dǎo)致中度陽性。ITGAM在ANCA-GN中呈強陽性，主要分布在腎小球和腎小管內(nèi)皮細(xì)胞中。TLR2和TLR7染色在ANCA-GN中呈強陽性（得分=3+），主要分布在腎小管上皮細(xì)胞和腎小球內(nèi)皮細(xì)胞中。LILRB2染色在ANCA-GN中呈現(xiàn)中度陽性（得分=2+），主要在腎小球和腎小管細(xì)胞中（圖10G）。該實驗證實了高通量測序數(shù)據(jù)和qPCR結(jié)果的一致性，表明NRGs在ANCA-GN中顯著過表達，并可能在ANCA-GN中發(fā)揮重要作用。

總結(jié)

總之，作者的研究通過全面的生物信息學(xué)分析系統(tǒng)地探索了AAV的潛在機制。同時，本研究還篩選出了一些關(guān)鍵基因和重要途徑，這可能有助于在ANCA-GN中尋找新的生物標(biāo)志物或治療靶點。為了更有針對性地探索ANCA-GN的病理生理機制，未來需要進行進一步的動物和臨床分子生物學(xué)實驗來驗證本研究的結(jié)果。