酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA）是目前應(yīng)用最廣泛的免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)，是將抗原-抗體反應(yīng)的特異性與酶催化作用的高效性相結(jié)合，通過(guò)酶作用于底物后的顯色反應(yīng)判定結(jié)果。一般用酶標(biāo)測(cè)定儀測(cè)定吸光度（OD值）來(lái)反映抗原或抗體含量，靈敏度可達(dá)每毫升納克（ng）水平甚至皮克（pg）水平。由于酶的催化效率很高，間接地放大了免疫反應(yīng)的結(jié)果，使測(cè)定方法達(dá)到很高的敏感度。

一、常用的ELISA方法

目前常用的ELISA方法有直接法、間接法、雙抗夾心法、競(jìng)爭(zhēng)法ELISA。

#01直接法

將抗原固定于ELISA班上，然后用酶標(biāo)抗體直檢測(cè)抗原。

相較于其他類(lèi)型的ELISA實(shí)驗(yàn)，直接ELISA實(shí)驗(yàn)步驟少，檢測(cè)速度快，不需要用到二抗，避免了交叉反應(yīng)，檢測(cè)結(jié)果不容易出錯(cuò)，

但是由于直接ELISA的抗原不是特異性固定的，樣本中的靶蛋白及其他雜質(zhì)蛋白都會(huì)與ELISA版結(jié)合，實(shí)驗(yàn)背景會(huì)比較高，而且直接ELISA每種靶蛋白都需要準(zhǔn)備能夠與其特異性結(jié)合的一抗，實(shí)驗(yàn)不太靈活。另外由于沒(méi)有使用二抗，信號(hào)沒(méi)有被放大，降低了測(cè)定的靈敏度。

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#02 間接法

將抗原固定于ELISA班上，隨后分兩步進(jìn)行檢測(cè)：首先加入檢測(cè)抗體于抗原特異性結(jié)合，隨后加入酶標(biāo)二抗檢測(cè)并利用底物顯色。

與直接ELISA相比，間接ELISA用到酶標(biāo)二抗，具有更高的靈敏度，也需要更少的標(biāo)記抗體，更經(jīng)濟(jì)，間接ELISA還提供了更大的靈活性，

缺點(diǎn)：存在交叉反應(yīng)的可能性（酶標(biāo)二抗直接與抗原結(jié)合），可能會(huì)增加背景，同時(shí)與直接ELISA相比，間接ELISA實(shí)驗(yàn)多了二抗孵育的步驟，實(shí)驗(yàn)周期延長(zhǎng)。

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03# 夾心法

被檢測(cè)的抗原包被再兩個(gè)抗體之間其中一個(gè)抗體將抗原固定于載體上，即捕捉抗體，另一個(gè)則是檢測(cè)抗體，此抗體可用酶標(biāo)記后直接測(cè)定抗原的量，或不標(biāo)記，再透過(guò)酶標(biāo)記的二級(jí)抗體來(lái)測(cè)定抗原的量，這兩種抗體必須小心選取，才可以避免交互反應(yīng)貨競(jìng)爭(zhēng)相同額抗原結(jié)合部位。

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04# 競(jìng)爭(zhēng)法

預(yù)先將抗原包被再固相載體上，并加入酶標(biāo)記的特異性抗體，實(shí)驗(yàn)是，加入待檢抗原（或抗體），如果待檢物是抗原，則待檢抗原于預(yù)先包被再固相載體上的抗原競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合酶標(biāo)抗體，如果待檢測(cè)物是抗體，則待檢抗體就與系統(tǒng)中原有的酶標(biāo)抗體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合包被再固相載體上的抗原，通過(guò)洗滌洗掉被競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合的酶標(biāo)抗體，最后加底物顯色，需要注意的是顯色結(jié)果與待檢抗原（或抗體）的量成反比。

競(jìng)爭(zhēng)ELISA相對(duì)以上的三種方法更復(fù)雜一些，但以上三種ELISA類(lèi)型都適用于競(jìng)爭(zhēng)ELISA的形式，其主要有點(diǎn)在于可檢測(cè)不純的樣品，且數(shù)據(jù)再現(xiàn)性高，但存在整體敏感性和專(zhuān)一性較差的問(wèn)題。

在測(cè)定蛋白質(zhì)等大分子時(shí)常用雙抗夾心ELISA方法，在敏感性基因特異性上有明顯的優(yōu)勢(shì)。

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?二、雙抗夾心法ELISA

#01?原理

雙抗體夾心法是檢測(cè)大分子抗原最常用的方法。雙抗夾心法ELISA是將特異性抗體結(jié)合到固相載體上形成固相抗體，然后和待檢樣本中的相應(yīng)抗原結(jié)合形成免疫復(fù)合物，洗滌后再加酶標(biāo)記抗體，與免疫復(fù)合物中抗原結(jié)合形成酶標(biāo)抗體—抗原—固相抗體復(fù)合物，加底物顯色，判斷抗原含量。

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#02?樣本準(zhǔn)備

A. 血清

全血標(biāo)本自然凝集30min后1000×g離心15min，取澄清，即可檢測(cè)。澄清可存放于-20℃，避免反復(fù)凍融。

B. 血漿

可用EDTA或肝素作為抗凝劑，標(biāo)本采集后30min內(nèi)于2-8℃1000×g 離心15min，或?qū)?biāo)本放于-20℃，避免反復(fù)凍融。（注意：標(biāo)本溶血會(huì)影響最后檢測(cè)結(jié)果，因此溶血標(biāo)本不宜進(jìn)行此項(xiàng)檢測(cè)）

C. 細(xì)胞上清

收集細(xì)胞培養(yǎng)液，離心取上清，-20℃存放，避免反復(fù)凍融。

D.細(xì)胞裂解樣本

①收集細(xì)胞后，用預(yù)冷的10mM PBS洗3次，5000×g離心5min。

②細(xì)胞計(jì)數(shù)，離心棄上清；

③加PMSF至細(xì)胞裂解液中，終濃度為1mM；

④按每1×107個(gè)細(xì)胞，加入1ml細(xì)胞裂解液（含PMSF），冰上裂解30min，其間上下顛倒使裂解更充分，超聲波破碎處理；

⑤?4℃，10000×g離心10min；

⑥檢測(cè)細(xì)胞裂解樣本總蛋白濃度；

⑦整個(gè)過(guò)程需在冰上操作，防止蛋白降解。

E. 組織裂解樣本

①加PMSF至細(xì)胞裂解液中，終濃度為1mM；

②預(yù)先將待檢組織用剪刀剪碎，液氮研磨，再按每100mg組織加1mL裂解液，用研磨器進(jìn)行研磨，得到的勻漿液可利用超聲破碎處理；

③4℃，10000×g離心10min，取上清，-80℃存放；

④檢測(cè)組織裂解樣本總蛋白濃度；

⑤整個(gè)過(guò)程需在冰上操作，防止蛋白降解。

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#03?實(shí)驗(yàn)操作流程

1.標(biāo)準(zhǔn)品和樣本制備

2.酶標(biāo)板拆分

3.標(biāo)準(zhǔn)品和樣本點(diǎn)樣

4.生物素抗體制備

5.洗液配制

6.濃縮HRP酶結(jié)合物工作液配制

7.顯色

8.終止反應(yīng)

9.上機(jī)與數(shù)據(jù)分析

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三、如何選擇ELISA試劑盒？

1、特異性：ELISA試劑盒的特異性于試劑盒的關(guān)鍵組分，抗體對(duì)有關(guān)，若抗體對(duì)中之一為多抗，另一個(gè)必須為單抗，建議使用雙單抗，

2、靈敏度：靈敏度反映的是試劑盒檢出被檢物質(zhì)的最低量的能力，用戶(hù)可根據(jù)自己樣本中待檢指標(biāo)的量選擇合適的試劑盒，如果待檢指標(biāo)量很低，一般的試劑盒不能滿(mǎn)足要求，可選擇高敏的ELISA試劑盒。

3、重復(fù)性：科學(xué)實(shí)驗(yàn)講求重復(fù)性，一般ELISA試劑盒，期板內(nèi)和板間變異系數(shù)應(yīng)該控制在15%以?xún)?nèi)。

4、簡(jiǎn)便性：試劑盒在保證高質(zhì)量數(shù)據(jù)的情況下，實(shí)驗(yàn)時(shí)間越短，操作越便利，越容易受到用戶(hù)歡迎；

?四、ELISA 試劑盒常見(jiàn)問(wèn)題解析

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五、10條ELISA 實(shí)驗(yàn)通用技巧

1.?室溫

確保所有試劑在使用前均平衡至室溫（除非另有說(shuō)明）。

2. 防潮

如果有剩余檢測(cè)孔，則將剩余的孔板密封保存，以防止有效成分降解。

3. 分裝

對(duì)于非一次性使用的標(biāo)準(zhǔn)品，將剩余標(biāo)準(zhǔn)品等分至較小體積并冷凍保存，以防止反復(fù)凍融。

4. 使用多道移液器

多道移液器可以加快標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的鋪板速度，并得到更一致的結(jié)果。

5. 加樣角度

加樣時(shí)，將移液器槍頭保持一定傾斜角度，不要接觸微孔底部。

6. 更換移液器槍頭

建議在不同樣品或標(biāo)準(zhǔn)品之間更換移液器槍頭，以防止污染。

7. 盡量使用洗板機(jī)

因?yàn)槭褂枚嗟酪埔浩魇謩?dòng)洗板可能導(dǎo)致更高的背景，因此建議使用洗板機(jī)。

8. 增加浸潤(rùn)時(shí)間

在手動(dòng)或用洗板機(jī)清洗微孔板時(shí)，在兩次洗板步驟之間增加?30 秒的浸潤(rùn)時(shí)間，便于洗滌緩沖液發(fā)揮功效。

9. 孵育時(shí)間

密切關(guān)注孵育時(shí)間，每小時(shí)孵育時(shí)間的誤差應(yīng)控制在?5 min 內(nèi)。

10. 多板操作，切勿疊放

如果正在進(jìn)行多板操作，請(qǐng)勿在孵育期間將微孔板堆疊在一起，而應(yīng)單獨(dú)放置在平坦表面上。

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六、ELISA與IHC、WB的區(qū)別

七、ELISA實(shí)驗(yàn)學(xué)習(xí)資料匯總