病毒的特點(diǎn):

1、形體微小,能通過(guò)細(xì)菌濾器，用電子顯微鏡才能觀察到。

2、無(wú)細(xì)胞結(jié)構(gòu),其主要成分是核酸和蛋白質(zhì)

3、每種病毒只含有一種類(lèi)型的核酸（RNA或DNA）

4、因缺乏完整的酶系統(tǒng)和能源，故只能寄生于活細(xì)胞內(nèi)，依靠宿主細(xì)胞的代謝系統(tǒng)合成蛋白質(zhì)和核酸

5、病毒以其基因?yàn)槟０澹谒拗骷?xì)胞內(nèi)復(fù)制出新的病毒顆粒

6、為了在生物界保存其種屬,病毒具備從一個(gè)宿主轉(zhuǎn)移到另一個(gè)宿主的能力，并具有對(duì)敏感宿主的侵染性和復(fù)制性

7、在宿主體外，能以大分子狀態(tài)存在，并可長(zhǎng)期保持其侵染能力

8、有些病毒的核酸能整合到宿主細(xì)胞的基因組中,并能誘發(fā)潛伏感染

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體外細(xì)胞培養(yǎng)的基本條件：

???1、條件要求高，培養(yǎng)液組分復(fù)雜，需要添加血清才能滿足生長(zhǎng)需要

???2、避免微生物污染,需要在培養(yǎng)液中加入抗生素.

???3、體外細(xì)胞培養(yǎng)的基本要求主要包括細(xì)胞接種（盡量選擇對(duì)數(shù)期細(xì)胞接種）、

???4、培養(yǎng)液營(yíng)養(yǎng)成分、

???5、酸堿度（能耐受的ph范圍為6.6-7.8,依靠緩沖系統(tǒng)調(diào)節(jié)）、

???6、氣體條件（細(xì)胞生長(zhǎng)需要CO2 ,大規(guī)模培養(yǎng)需要有足夠的氧氣）、

???7、溫度(最適溫度為35—37。C）、

???8、水的純度（一般要求去離子水或三蒸水）、

???9、無(wú)菌條件等

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實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的微生物控制分類(lèi)：

1、?普通動(dòng)物，一級(jí)動(dòng)物，要求不攜帶動(dòng)物烈性傳染病和人獸共患病病原

2、?清潔動(dòng)物，二級(jí)動(dòng)物，在一級(jí)動(dòng)物要求上，不攜帶對(duì)動(dòng)物危害大、對(duì)實(shí)驗(yàn)干擾大的病原體，外觀健康，主要器官不得有組織病理學(xué)病變

3、?無(wú)特定病原體動(dòng)物，三級(jí)動(dòng)物，除普通動(dòng)物、清潔動(dòng)物不得攜帶病原體外,還要求排除潛在感染或條件致病菌的感染

4、?無(wú)菌動(dòng)物，四級(jí)動(dòng)物，要求在體內(nèi)外不得檢出其它生命體

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實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的遺傳學(xué)分類(lèi)

1、?近交系，指經(jīng)過(guò)連續(xù)20代以上全同胞或親子交配培育的動(dòng)物品系

2、?封閉系，不從外界引入新的血緣，非近親交配方式的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物群體

3、?突變系，由于遺傳基因發(fā)生突變而具有某些特殊形狀的動(dòng)物

4、?雜交群動(dòng)物，由不同品系雜交所產(chǎn)生的后代

5、?轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，插入外源基因后能正常繁殖的動(dòng)物

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大鼠、小鼠的采血方法

1、?剪尾采血，動(dòng)物麻醉后，將尾端剪去約5mm，待血液流出采集，小鼠可每次采血0.1ml，大鼠約0.4ml

2、?眼眶后靜脈叢采血,拇指及食指抓住鼠兩耳之間的皮膚固定，輕輕壓迫頸部?jī)蓚?cè)，使眼球充分外凸。采血管插入眼角與眼球之間，向眼底方向刺入,切開(kāi)靜脈叢，血流即流入取血管。

3、?

4、?頸（股)動(dòng)脈或頸（股）靜脈采血，麻醉動(dòng)物，剪去被毛，作頸靜脈或勁動(dòng)脈分離術(shù)后采血

5、?摘眼球采血，采血時(shí)，用左手固定動(dòng)物，壓迫眼球，盡量使眼球凸出，右手用彎頭鑷子摘除眼球，迅速采集血液

病毒的純化方法：

一般原則釋放病毒至細(xì)胞外、去除細(xì)胞碎塊、病毒懸液濃縮

1、?PEG濃縮法，包括直接加入法、液體濃縮法、固體濃縮法

2、?超過(guò)濾法

3、?吸附法，有凝膠吸附法、紅細(xì)胞吸附法

4、?超速離心法

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中和試驗(yàn)及其應(yīng)用

是在體外適當(dāng)條件下孵育病毒與特異性抗體的混合物，使病毒與抗體相互反應(yīng)，再將混合物接種到敏感的宿主體內(nèi)，然后測(cè)定殘存的病毒感染力的一種方法。 通常以100TCID50/單位體積或100LD50/單位體積作為標(biāo)準(zhǔn)的病毒試驗(yàn)濃度

1、鑒定病毒、

2、分析病毒抗原的性質(zhì)、

3、測(cè)定免疫血清的抗體效價(jià)和疫苗接種后的效果、

4、測(cè)定病人血清中的抗體,用于診斷病毒性疾病

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雞胚培養(yǎng)的優(yōu)缺點(diǎn)

優(yōu)點(diǎn)

1、?組織分化程度低，病毒易于繁殖

2、?來(lái)源充足，其本身很少攜帶病毒和細(xì)菌，敏感范圍廣，對(duì)接種的病毒不產(chǎn)生抗體

3、?有神經(jīng)血管的分布和臟器的構(gòu)造

缺點(diǎn)

1、?與除引起雞胚死亡的病毒及產(chǎn)生痘皰的病毒外，通常不產(chǎn)生特異性的感染指癥，必須通過(guò)另外的實(shí)驗(yàn)來(lái)證明病毒的存在

2、?雞食入的抗生素會(huì)使某些病原體的繁殖收到抑制

3、?某些細(xì)菌和病毒能夠從感染的雞傳遞到雞胚

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PCR(聚合酶鏈反應(yīng)）基本反應(yīng)體系和步驟

反應(yīng)體系?：需要擴(kuò)增的模板、與DNA靶序列3'末端互補(bǔ)的合成引物、4種三磷酸脫氧核糖核苷酸dNTP、耐熱DNA聚合酶、合適的緩沖液體系。

基本步驟與反應(yīng)：

1、變性，將反應(yīng)體系混合物加熱至94?C,維持約30～60秒，使待測(cè)雙鏈DNA變性解鏈為單鏈模板.

2、2、退火，冷卻至特定的溫度(引物的Tm值左右，一般為45～65?C），一對(duì)寡糖核苷酸引物分別與正、負(fù)單鏈DNA序列兩端互補(bǔ)結(jié)合。

3、延伸,將溫度提高至72?C并維持一段時(shí)間,引物在聚合酶作用下，以3? 端為起點(diǎn)，4種dNTP為原料，按堿基配對(duì)原則，沿5?→3?方向延伸，合成兩條新DNA鏈。

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基因克隆以及基本步驟：

利用酶將不同來(lái)源的DNA分子在體外進(jìn)行特異性切割、重組連接、組成新的DNA重組子，導(dǎo)入宿主細(xì)胞，隨著宿主細(xì)胞的繁殖從而得到大量自帶DNA重組子或其表達(dá)產(chǎn)物。

基本步驟：

1、分離或合成目的基因

2、將目的基因在體外插入載體形成重組DNA

3、將重組DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞

4、重組體的篩選、鑒定和分析

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乙肝病人血清學(xué)檢測(cè)的五項(xiàng)指標(biāo)：

HBsAg（表面抗原）、抗-HBs（表面抗體）、抗—HBc（核心抗體）、HBeAg（e抗原）、抗-HBe(e抗體）

乙肝病毒血清學(xué)檢查三種主要抗體及其意義

??????????1、抗—HBe一般存在于無(wú)癥狀HBV攜帶者及活動(dòng)期慢性肝炎患者中。

??????????2、抗-HBs:是HBsAg刺激機(jī)體產(chǎn)生的特異性中和抗體，是保護(hù)性抗體.陽(yáng)性表明機(jī)體已經(jīng)產(chǎn)生免疫力 ????????

??????????3、抗—HBc:包括抗-HBcIgM、抗—HbcIgG，前者是急性感染的重要指標(biāo),也是慢性活動(dòng)肝炎的重要標(biāo)志.陽(yáng)性主要見(jiàn)于乙肝恢復(fù)期，慢性感染和既往感染。

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空斑形成單位（PFUs)試驗(yàn)：是將不同稀釋倍數(shù)的動(dòng)物病毒與平鋪于平板表面的宿主細(xì)胞混合,當(dāng)病毒顆粒在一大片宿主細(xì)胞上引發(fā)感染時(shí),會(huì)造成細(xì)胞被溶解而形成空斑,每個(gè)空斑系由一個(gè)病毒顆粒所造成，計(jì)算空斑數(shù)目再乘以稀釋倍數(shù),即可得知原來(lái)的病毒感染單位的濃度.凡是能在細(xì)胞培養(yǎng)物中產(chǎn)生CPE的病毒都可用空斑技術(shù)來(lái)測(cè)定其滴度.

50％終點(diǎn)法：是將病毒懸浮液經(jīng)一系列稀釋后，接種至動(dòng)物、雞胚或培養(yǎng)成單層的細(xì)胞,將每個(gè)稀釋度造成的動(dòng)物、雞胚致死量或細(xì)胞病變做曲線，找出造成50%動(dòng)物、雞胚死亡或病變的終點(diǎn)稀釋度。

ID50：即是指可造成50%動(dòng)物或雞胚感染的劑量

CCID50:造成50%細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)生病變效應(yīng)的劑量

LD50：為造成50％動(dòng)物或雞胚死亡的病毒含量

血凝試驗(yàn)（HA）：有些病毒和病毒表面的血凝素能引起人或某些哺乳動(dòng)物的紅細(xì)胞發(fā)生凝集,這就是所謂的紅細(xì)胞凝集現(xiàn)象。當(dāng)病毒數(shù)與紅細(xì)胞數(shù)比值足夠大時(shí),病毒會(huì)與紅細(xì)胞結(jié)合成網(wǎng)狀，造成懸浮液沉淀或凝集

血凝滴度HT：將紅細(xì)胞與一系列病毒稀釋液混合.造成凝血的最高稀釋倍數(shù)即為血凝滴度

電鏡分辨率:是指分清楚兩個(gè)點(diǎn)或兩條線中心之間的最小距離的能力

負(fù)染色技術(shù)：高密度物質(zhì)如重金屬磷鎢酸、醋酸鈾等在透射電鏡下形成黑色的背景反襯低密度的標(biāo)本，從而清楚的顯示出被襯物的細(xì)節(jié)結(jié)構(gòu)

質(zhì)粒：是存在于細(xì)菌染色體之外的、可自主復(fù)制的雙鏈環(huán)狀DNA，幾乎完全裸露,易于分離純化。

核酸雜交技術(shù)：用特定標(biāo)記的已知核酸序列與待測(cè)核酸進(jìn)行特異性結(jié)合,形成雜交體，并體用相應(yīng)的顯示技術(shù)檢測(cè)目標(biāo)核酸的存在及其位置。

Southern印跡雜交：一是將待測(cè)定核酸DNA分子通過(guò)一定的方法轉(zhuǎn)移并結(jié)合到一定的固相支持物(硝酸纖維素膜或尼龍膜）上，即印跡（blotting）；二是固定于膜上的核酸與同位素標(biāo)記的探針在一定的溫度和離子強(qiáng)度下退火，即分子雜交過(guò)程。步驟包括：1、待測(cè)核酸樣品的制備與限制酶消化2、瓊脂糖凝膠電泳分離待測(cè)DNA樣品3、電泳凝膠的預(yù)處理4、轉(zhuǎn)膜5、探針標(biāo)記6、預(yù)雜交與southern雜交7、洗膜8、放射性自顯影檢測(cè)。

Nouthern印跡雜交：將RNA樣品通過(guò)瓊脂凝膠電泳進(jìn)行分離，再轉(zhuǎn)移到固相支持物上，用探針對(duì)其進(jìn)行雜交,將具有陽(yáng)性的位置與標(biāo)準(zhǔn)相對(duì)分子質(zhì)量進(jìn)行比較可得到RNA種類(lèi)的數(shù)目、分子大小及豐度等信息。

Ct值：值每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)，每個(gè)模板的Ct值與其起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多,Ct值越小。

核酸探針：是指以研究和診斷為目的，帶有標(biāo)記物的已知序列的核酸片段,它能和與其互補(bǔ)的核酸序列雜交，用來(lái)檢測(cè)特定序列核酸的DNA或RNA片段。

Tm值：Tm值就是DNA熔解溫度,指把DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)降解一半時(shí)的溫度，Tm = 4℃(G + C)+ 2℃（A + T)

CPE細(xì)胞病變效應(yīng)：是病毒或接種分離標(biāo)本后.細(xì)胞出現(xiàn)的病理性變化。不同的病毒可引起不同的細(xì)胞病變效應(yīng)。

干擾現(xiàn)象interference phenomenon：一種病毒感染細(xì)胞后，可以干擾另一種病毒在細(xì)胞內(nèi)的增值。

復(fù)性:變性DNA在適當(dāng)?shù)臈l件下，兩條彼此分開(kāi)的鏈又可重新結(jié)合成為雙螺旋結(jié)構(gòu)，這個(gè)過(guò)程稱為復(fù)性。方法是緩慢冷卻。

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