前言

2022年07月，中山大學(xué)附屬第六醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)研究中心劉貴華主任醫(yī)師、陳培根博士、梁曉燕教授（一作：楊星副主任醫(yī)師）研究團(tuán)隊在 Microbiology Spectrum期刊發(fā)表了題為 “Interaction between Cervical Microbiota and Host Gene Regulation in Caesarean Section Scar Diverticulum”的研究成果，采用微生物組學(xué)、代謝組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)等研究方法，全面描述了剖宮產(chǎn)瘢痕憩室中微生物群的異常活動特征以及宿主-微生物群相互作用的機(jī)制。揭示了潛在有害微生物確實(shí)對宿主子宮內(nèi)膜有不利影響。這些不良反應(yīng)的機(jī)制包括抑制有益細(xì)菌（如乳酸桿菌）的活性，消耗子宮內(nèi)膜的保護(hù)性代謝物，以及有害代謝物的產(chǎn)生。研究從微生物、代謝和宿主反應(yīng)的角度闡明了該機(jī)制，為剖宮產(chǎn)瘢痕憩室的預(yù)防和治療策略提供了重要依據(jù)。

中文標(biāo)題：剖宮產(chǎn)瘢痕憩室中宮頸微生物群與宿主基因調(diào)控的相互作用

研究對象：人

發(fā)表期刊：Microbiology Spectrum

影響因子：9.043

發(fā)表時間：2022 年07月 28日

合作單位 : 中山大學(xué)附屬第六醫(yī)院

涉及歐易/鹿明生物技術(shù)：微生物組、轉(zhuǎn)錄組、代謝組

研究背景

接受剖宮產(chǎn)手術(shù)的女性可能會患上剖宮產(chǎn)瘢痕憩室 (CSD)。CSD是由于子宮局部切口愈合不良，形成與子宮腔相連的凹陷或空腔，可導(dǎo)致各種近期和遠(yuǎn)期并發(fā)癥，之前的研究表明，持續(xù)性積液是影響 CSD 女性生育能力的主要因素。

女性生殖道具有獨(dú)特的微生物組，在維持體內(nèi)平衡和某些疾病的發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用。當(dāng)生態(tài)失調(diào)發(fā)生時，改變的免疫和代謝信號會產(chǎn)生相應(yīng)的反應(yīng)，包括慢性炎癥、上皮屏障破壞、血管生成和代謝失調(diào)。之前的研究表明，CSD 持續(xù)性積液是由局部炎癥和免疫失衡引起的，而局部微生物干擾在這一過程中起著核心作用。然而，局部微生物群活動的特征和微生物與宿主相互作用的機(jī)制仍然未知。在本研究中，將非靶向代謝組學(xué)和人類宿主轉(zhuǎn)錄組相結(jié)合，分析了CSD微生物的活性特征以及微生物與宿主相互作用的機(jī)制。

研究思路

研究結(jié)果

1、宮頸微生物群的多樣性和組成特征

研究共納入 52 名受試者，其中 CSD 組 28 名，CON 組 24 名。通過Shannon-Wiener指數(shù)計算的CSD組門（圖1A）和屬水平（圖1B ）微生物群的α多樣性顯著高于CON組，表明CSD組的微生物組成顯著高于CON組。CSD組更豐富?；?Bray-Curtis 的 PCoA 圖和 ANOSIM 分析顯示，CSD 組樣本之間的距離明顯大于 CON 組（圖 1C）。門水平的分類在兩組之間顯示出不同的模式，在CON組中厚壁菌門占絕大多數(shù)（圖1D）。在 CSD 組中，厚壁菌門的比例下降到 62%，變形菌門和放線菌門的比例分別增加到 20% 和 10%（圖 1E）。兩組在屬水平上的組成也呈現(xiàn)出顯著差異。

本研究剖析了兩組之間厚壁菌門和變形菌門的屬組成。在厚壁菌門下， CSD組（圖1F ）的乳酸菌比例較CON組（圖1H）下降，而鏈球菌和腸球菌的比例增加， CSD 組（圖 1G）和 CON 組（圖 1I）之間存在不同程度的差異。這些結(jié)果表明，CSD組微生物群的多樣性和組成與CON組有顯著差異， CSD組乳酸桿菌的比例顯著降低。

圖1 | 微生物群落特征

2、差異菌群篩選與共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

基于線性判別分析（LDA），篩選出兩組之間的差異屬。CSD組乳酸菌明顯減少，而加德納菌、普氏菌等有害菌明顯增加（LDA≥2）（圖2A）。

基于Spearman相關(guān)分析（R ?>0.8，P <0.05）構(gòu)建的屬共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)（圖2B ）。由Ralstonia、Sphingomonas和Sediminbacterium組成的共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)與乳酸桿菌呈顯著負(fù)相關(guān)。這四個屬的豐度在兩組之間是相反的（圖2C-F）。這一結(jié)果表明，乳酸菌豐度的下降可能是由微生物群落的干擾和互斥引起的。

圖2 |? 微生物群的組成差異和共現(xiàn)關(guān)系

3、微生物群的功能富集分析

PICRUSt 2 的結(jié)果表征了兩組微生物群的活性。作者分別分析了 KEGG 通路的 2 級和 3 級。CSD組在多種代謝過程中表現(xiàn)出顯著的活性，除了碳水化合物代謝，這是乳酸產(chǎn)生的重要途徑（圖3A）。在更精細(xì)的途徑（3級，圖3B）中，CSD組在脂肪酸代謝途徑和次生代謝物的生物合成中表現(xiàn)出高活性，而CON組中活躍的碳水化合物代謝途徑被精細(xì)化為葡萄糖代謝。CON組的磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)（PTS）和果糖、甘露糖代謝也比CSD組更活躍（圖3B）。

圖3 |? 宮頸微生物的功能表征

4、宮頸環(huán)境中的非靶向代謝組學(xué)

對來自 60 名受試者的樣本同時進(jìn)行非靶向代謝組學(xué)分析。作者獲得了 6,130 種代謝物。OPLS-DA 用于區(qū)分代謝譜的總體差異，并進(jìn)一步識別組間的差異代謝物。結(jié)果表明，CSD 組內(nèi)的樣本聚集在一起，與 CON 組的整體概況不同（圖 4A、B）。確定了兩組之間顯著差異的 34 種代謝物（圖 4C）。CSD 組中兩種代謝物顯著上調(diào)；即N-(3-羥基-二十烷?；?-高絲氨酸內(nèi)酯和Ternatin。32種代謝物顯著下調(diào)，其中兩種顯著下調(diào)的代謝物是Gingerol和PC(O-10:0/O-8:0)[U]。

圖4 |? 宮頸環(huán)境中的非靶向代謝組學(xué)

5. 宮頸微生物群與代謝組的相關(guān)性

為了進(jìn)一步探索 CSD 中宮頸微生物的致病機(jī)制，作者對宮頸微生物組和代謝組進(jìn)行了綜合分析（圖 5）。作者發(fā)現(xiàn)許多與乳酸菌呈正相關(guān)的代謝物與普氏菌屬、鞘氨醇單胞菌屬、拉爾斯頓菌屬等呈負(fù)相關(guān)。兩種代謝物與乳酸菌呈顯著正相關(guān)，包括抗肽素C（R ?= 0.39）和3-表苦苷酸（R?= 0.39)。然而，N-乙酰-a-神經(jīng)氨酸、N-乙酰-b-神經(jīng)氨酸、N-(3-羥基-二十烷?；?-高絲氨酸內(nèi)酯和Ternatin與與乳酸桿菌互斥的各種屬呈負(fù)相關(guān)。

圖5 |? ?差異代謝物與差異屬關(guān)聯(lián)分析的熱圖（Spearman 相關(guān)分析）

6. 人類宿主子宮內(nèi)膜反應(yīng)

為了進(jìn)一步了解人類宿主對受干擾的微生物群落的反應(yīng)，作者對剖宮產(chǎn)瘢痕憩室周圍的子宮內(nèi)膜進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測序。作者對 33 個與微生物組和代謝組配對的樣本進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組分析，其中包括來自 CSD 組的 18 個樣本和來自 CON 組的 15 個樣本。兩組之間共鑒定出982個差異表達(dá)基因（圖6A），其中176個基因在CSD中上調(diào)，806個基因下調(diào)（圖6B）。作者注意到 CSD 組中上調(diào)的基因負(fù)調(diào)控血管內(nèi)皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和上皮細(xì)胞的增殖（圖 6C）。同時，這些基因在內(nèi)皮細(xì)胞凋亡過程中也很活躍。這表明局部血管生成在 CSD 組中受到阻礙。下調(diào)基因主要集中在免疫系統(tǒng)相關(guān)過程中（圖6D）。

圖6 |? 子宮內(nèi)膜轉(zhuǎn)錄組表達(dá)特征

通過構(gòu)建O2PLS模型實(shí)現(xiàn)了微生物與轉(zhuǎn)錄組的整合。經(jīng)過10次交叉驗證，終將模型構(gòu)建參數(shù)設(shè)置為n ?= 5，nx = 3，ny = 1，R2X為0.91，R2Y為0.90（圖7A）。這兩個參數(shù)表明模型是可靠的。圖 7B顯示了兩個組學(xué)的前 15 個加載特征。對兩組前30名加載的特征進(jìn)行了Spearman相關(guān)分析，試圖找出特定屬與基因之間的關(guān)系。

作者發(fā)現(xiàn)了幾個特定基因，包括 DKK1、CXCL14、SCARA5、APOD、S100A4、CFD、GPX3 和 HBB。這些基因與與乳酸桿菌互斥的屬顯著正相關(guān)（圖2B ）但與乳酸桿菌負(fù)相關(guān)（圖7C）。這些基因的功能富集分析結(jié)果表明，它們主要活躍于細(xì)胞連接組裝的負(fù)調(diào)控和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的過程中（圖7D）。細(xì)胞連接組裝是血管生成的重要過程。這一結(jié)果表明，CSD形成過程中的血管生成障礙和內(nèi)膜增生障礙與微生物障礙密切相關(guān)。

圖7 |? 宿主-微生物群相互作用分析

相關(guān)討論

本研究試圖從多個角度解釋宮頸微生物群和代謝物對 CSD 女性的影響，包括微生物角度和人類宿主反應(yīng)角度。作者觀察到，CSD組宮頸菌群結(jié)構(gòu)與對照組不同。CSD組乳酸菌明顯減少，而潛在有害菌種的比例和豐度增加。乳酸桿菌的優(yōu)勢與私密處健康有關(guān)，該屬的消耗可導(dǎo)致許多不利條件。在共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)中，作者發(fā)現(xiàn)乳酸桿菌與三種潛在的致病細(xì)菌之間存在相互排斥的關(guān)系，很可能是CSD 組中乳酸桿菌減少的重要機(jī)制。

此外，觀察到CSD組顯著降低了碳水化合物代謝二級通路和半乳糖代謝三級通路的活性。半乳糖代謝途徑是乳酸桿菌產(chǎn)生乳酸的重要途徑，這一結(jié)果也證實(shí)了乳酸桿菌的活性在CSD組中受到抑制。CSD 組微生物群的另一個活躍特征是脂肪酸的活躍代謝。這一結(jié)果表明，脂肪酸在 CSD 組中被大量消耗。因此，乳酸菌代謝活性的抑制和潛在致病菌的脂肪酸代謝活躍是CSD組的重要特征，這可能是造成不良生殖能力的重要原因。

為了驗證基于序列的微生物活性表征并評估 CSD 和對照組之間宮頸代謝物的差異，在兩組中鑒定了 34 種差異代謝物。代謝組學(xué)結(jié)果再次證實(shí)了我們基于微生物組數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)的共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)中的互斥關(guān)系，即乳酸桿菌的豐度和活性。被顯著抑制，多種有益脂肪酸被大量消耗。

進(jìn)一步作者對 CSD 周圍的子宮內(nèi)膜進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測序。CSD組顯著上調(diào)基因的GO富集分析表明，這些基因集中在負(fù)調(diào)控血管內(nèi)皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和上皮細(xì)胞增殖的生物學(xué)過程中。在整合微生物組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)后，作者發(fā)現(xiàn)調(diào)節(jié)這些功能的基因是之前數(shù)據(jù)中鑒定的潛在致病菌，乳酸桿菌與這些不利的生物活性呈負(fù)相關(guān)。

到目前為止，作者已經(jīng)揭示了潛在的有害微生物確實(shí)對宿主子宮內(nèi)膜產(chǎn)生了不利影響。這些不良反應(yīng)的機(jī)制包括抑制有益細(xì)菌（如乳酸桿菌）的活性，消耗子宮內(nèi)膜的保護(hù)性代謝物，以及產(chǎn)生有害代謝物。

據(jù)作者所知，這是詳細(xì)研究 CSD 中微生物群落紊亂的致病機(jī)制的研究。利用微生物群的組成和活性特征，已經(jīng)開發(fā)出開發(fā)新的和更有效的益生菌制劑的想法。

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中山大學(xué)附屬第六醫(yī)院研究團(tuán)隊為了揭示剖宮產(chǎn)瘢痕憩室中宮頸微生物群與宿主基因調(diào)控的相互作用。綜合采用微生物組、代謝組和轉(zhuǎn)錄組等研究方法，全面描述了剖宮產(chǎn)瘢痕憩室中微生物群的異?；顒犹卣饕约八拗?微生物群相互作用的機(jī)制。為剖宮產(chǎn)瘢痕憩室的預(yù)防和治療策略提供了重要依據(jù)。

實(shí)驗技術(shù)上驗證了基于序列的微生物活性表征并評估 CSD 和對照組之間宮頸代謝物的差異，再次證實(shí)了基于微生物組數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)的共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)中的互斥關(guān)系。

楊星副主任醫(yī)師為本篇作者，通訊作者為劉貴華主任醫(yī)師、陳培根博士、梁曉燕教授，基金：中山大學(xué)附屬第六醫(yī)院人才項目

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