細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)在生物研究領(lǐng)域內(nèi)是必不可少的核心環(huán)節(jié)，在培養(yǎng)過程中面臨的一個(gè)嚴(yán)重問題就是細(xì)胞污染，其中支原體是最主要的污染源。支原體在光學(xué)顯微鏡下不可見，而且被支原體污染的細(xì)胞培養(yǎng)基在一般情況下往往并不渾濁，細(xì)胞受損程度也不明顯，形態(tài)很少改變，因此細(xì)胞被支原體污染后很難察覺。細(xì)胞一旦被支原體污染后，支原體會消耗細(xì)胞培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)，代謝產(chǎn)物不斷積累，會導(dǎo)致細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境中pH值的改變，誘導(dǎo)或抑制某些細(xì)胞因子的表達(dá)，會影響培養(yǎng)細(xì)胞的代謝和增殖特征。

在日常工作環(huán)境中，支原體可以說無處不在，它可以通過人的毛發(fā)、口腔、穿著的衣服、動物的皮毛以及日常的細(xì)胞培養(yǎng)的操作環(huán)境造成對細(xì)胞的污染。能夠造成細(xì)胞污染的支原體種類有很多，有些細(xì)胞甚至同時(shí)感染2種以上的支原體。由于支原體體積很小，直徑約在0.2-2.0pm之間，可以通過濾膜而直接造成培養(yǎng)基或血清的污染。從形態(tài)結(jié)構(gòu)上，支原體形態(tài)多變，多吸附在細(xì)胞表面或分散于細(xì)胞與細(xì)胞之間，是一類沒有細(xì)胞壁的微生物，因此對作用于細(xì)胞壁類的抗生素（如青霉素）不敏感。

常用的檢測方法有培養(yǎng)法、熒光染色法、PCR法和電鏡觀察法。

培養(yǎng)法

培養(yǎng)法是最為可靠且成本低廉的方法，但培養(yǎng)周期較長，常用于細(xì)胞以及臨床治療細(xì)胞的支原體檢査；

熒光染色法

熒光染色法是用特異熒光染料（Hoechst 33258）染色后在熒光顯微鏡下進(jìn)行檢測，熒光染料(Hoechst 33258)是一種能和DNA特異結(jié)合物質(zhì)，如果檢測樣品為支原體污染，則附在細(xì)胞表面和分散在細(xì)胞與細(xì)胞之間的支原體DNA著色，在熒光顯微鏡下可見；

PCR法和電鏡觀察法

PCR法檢測是通過對支原體特定的序列設(shè)計(jì)引物，當(dāng)存在支原體污染時(shí)通過PCR特異性擴(kuò)增，會將目標(biāo)DNA特異性的復(fù)制，然后通過瓊脂糖電泳觀檢測，會跑出條帶出現(xiàn)陽性結(jié)果，反之當(dāng)沒有支原體污染時(shí)，由于沒有模板，PCR無法擴(kuò)增，則瓊脂糖電泳跑不出條帶，出現(xiàn)陰性結(jié)果；電鏡觀察法是利用電子顯微鏡的超級放大功能，直接觀察培養(yǎng)細(xì)胞中支原體污染情況。

下面為您介紹利用熒光染色法來檢測培養(yǎng)細(xì)胞中的支原體。

熒光染色法檢測步驟

（1）細(xì)胞爬片培養(yǎng)：待測細(xì)胞培養(yǎng)至傳代水平，將細(xì)胞消化后接種至含有玻片的細(xì)胞板中，培養(yǎng)至60%-70%匯合時(shí)，進(jìn)行檢測；

（2）漂洗：將細(xì)胞板中的培養(yǎng)液吸出，取出玻片，用PBS輕輕漂洗；

（3）固定：加入適量的固定液，室溫放置10min；

（4）漂洗：用PBS輕輕漂洗3次；

（5）染色：加入適量的熒光染料（Hoechst 33258）工作液，在室溫下放置10min；

（6）漂洗：用PBS輕輕漂洗3次；

（7）鏡下觀察：將玻片晾干后，滴加抗熒光猝滅劑，于熒光顯微鏡下觀察、拍照；

（8）實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖所示：?

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圖1

只觀察到細(xì)胞的細(xì)胞核，說明細(xì)胞沒有被支原體的污染

圖2

圖2

可見細(xì)胞核外與細(xì)胞表面會出現(xiàn)藍(lán)色螢光小點(diǎn)或是絲狀點(diǎn)，其形狀各異，與細(xì)胞共同被染成不規(guī)則的點(diǎn)狀物，說明細(xì)胞被支原體污染