粥樣硬化型心血管疾病（Atherosclerotic cardiovascular disease，CVD)是當(dāng)前人類面臨的主要致死性疾病之一，也是當(dāng)前心血管疾病研究熱點(diǎn)，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)是研究和探索治療心血管疾病途徑必不可少的環(huán)節(jié)。

常見(jiàn)動(dòng)脈粥樣硬化動(dòng)物模型包括Apoe敲除小鼠、Ldlr敲除小鼠、在其基礎(chǔ)上調(diào)控其他基因的品系以及其他基因調(diào)控方式調(diào)控相關(guān)基因的動(dòng)物模型（表1）。

表1.不同動(dòng)脈粥樣硬化小鼠對(duì)比

Pcsk9D377Y在動(dòng)脈粥樣硬化模型小鼠中的應(yīng)用

轉(zhuǎn)基因動(dòng)脈粥樣硬化模型小鼠在是實(shí)驗(yàn)上存在一定的限制，如沒(méi)有相關(guān)課題時(shí)需要一直保種飼養(yǎng)，隨后，大量繁殖集齊數(shù)量足夠年齡相近的小鼠也需要時(shí)間，近年來(lái)，科學(xué)家們建立了一種快速、簡(jiǎn)便、通用和經(jīng)濟(jì)有效的、利用病毒注射野生型小鼠的造模方式：AAV9-Pcsk9D377Y尾靜脈注射。

Pcsk9D377Y過(guò)表達(dá)是近幾年新出現(xiàn)的動(dòng)脈粥樣硬化急性模型之一。前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草溶菌素轉(zhuǎn)化酶9 (proprotein convertase subtilisin/kexin type 9, Pcsk9）主要由肝臟表達(dá)，介導(dǎo)一些受體的降解，在膽固醇和脂肪酸的代謝中起到重要作用。

Pcsk9能與肝細(xì)胞表面低密度脂蛋白受體 (low density lipoprotein receptor, LDLR) 結(jié)合, 構(gòu)成復(fù)合物并靶向轉(zhuǎn)運(yùn)到溶酶體內(nèi)進(jìn)行降解, 從而阻斷LDLR在細(xì)胞膜表面的循環(huán)途徑, 抑制低密度脂蛋白膽固醇 (low density lipoproteincholesterol, LDL-C) 通過(guò)LDLR轉(zhuǎn)運(yùn)從體內(nèi)清除代謝, 使得血漿中LDL-C升高, 最終導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化 (atherosclerosis, AS) 的形成1,2。過(guò)表達(dá)突變的Pcsk9D377Y，能加速LDLR的降解，嚴(yán)重影響血漿中LDL-C的清除能力，最終導(dǎo)致高脂血癥。因此我們利用這原理，以AAV作為過(guò)表達(dá)Pcsk9D377Y的載體，使用APOE的啟動(dòng)子確保能在肝臟中特異表達(dá)，誘導(dǎo)野生型小鼠產(chǎn)生動(dòng)脈粥樣硬化，AAV結(jié)構(gòu)如圖1所示。

圖1. AAV9-Pcsk9D377Y示意圖

該模型的構(gòu)建方法也十分簡(jiǎn)單,AAV病毒進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)后能傾向于在肝臟中富集，因此，病毒的遞送至肝臟十分簡(jiǎn)單。構(gòu)建模型時(shí)，野生型C57小鼠通過(guò)尾靜脈注射即可構(gòu)建成功。

該產(chǎn)品使用的APOE啟動(dòng)子是肝臟載脂蛋白的增強(qiáng)子嵌合抗胰蛋白酶的啟動(dòng)子構(gòu)成的肝臟特異啟動(dòng)子ApoEHCR-hAAT，可以確保病毒的作用局限于肝臟細(xì)胞，防止Pcsk9作用其他細(xì)胞產(chǎn)生實(shí)驗(yàn)的干擾。配合漢恒高滴度的純化技術(shù)，病毒滴度可達(dá)到1*10^13v.g./ml，在保證注射的病毒顆粒數(shù)量同時(shí)極大的減少尾靜脈注射的體積，減少動(dòng)物的傷害。

總之，這種方法構(gòu)建的動(dòng)物模型十分簡(jiǎn)便，見(jiàn)效快，而且效果能維持很久3，不需要繁瑣耗時(shí)的轉(zhuǎn)基因小鼠的配種，極大地縮減了實(shí)驗(yàn)流程。

AAV9-Pcsk9D377Y注射誘導(dǎo)動(dòng)脈模型的詳細(xì)流程：

01

小鼠飼養(yǎng)

小鼠的飼養(yǎng)應(yīng)在SPF的級(jí)別或其他學(xué)術(shù)界公認(rèn)的條件下飼養(yǎng)，必須經(jīng)由有關(guān)專業(yè)培訓(xùn)的飼養(yǎng)員管理。

整個(gè)實(shí)驗(yàn)流程小鼠應(yīng)處在穩(wěn)定受控的培養(yǎng)條件，包括21°±2°C, 50%±10%相對(duì)濕度，12小時(shí)光照和12小時(shí)黑暗循環(huán)飼養(yǎng)。

小鼠在手術(shù)前一周能隨意獲取,并有充足的標(biāo)準(zhǔn)的飼料；

02

? AAV注射

每只小鼠尾靜脈注射1X1011v.g.以上總量的PCSK9 D377Y過(guò)表達(dá)病毒或?qū)φ詹《荆褂蒙睇}水將兩種病毒稀釋為相同體積，且總體積不能超過(guò)150μl，注射后使用WD飼料或Paigen飼料飼養(yǎng)12周左右；

Pcsk9D377Y過(guò)表達(dá)AAV現(xiàn)貨供應(yīng)

漢恒生物擁有人源、鼠源Pcsk9突變體過(guò)表達(dá)腺相關(guān)病毒（AAV9-CMV/APOE-Pcsk9D377Y），供動(dòng)脈粥樣硬化研究者造模使用，現(xiàn)貨供應(yīng)，質(zhì)量有保證。詳情垂詢【400-092-0065】。

1、Schulz R, Schlüter KD, Laufs U.Molecular and cellular function of the proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 (PCSK9) [J].Basic Res Cardiol, 2015, 110 (2) :1-19.

2、Seidah NG, Sadr MS, Chrétien M, et al.The multifaceted proprotein convertases:their unique, redundant, complementary, and opposite functions[J].J Biol Chem, 2013, 288 (30) :21473-21481.

3、Kumar S, Kang DW, Rezvan A, Jo H. Accelerated atherosclerosis development in C57Bl6 mice by overexpressing AAV-mediated PCSK9 and partial carotid ligation. Laboratory investigation; a journal of technical methods and pathology. 2017;97(8):935-945.

小提示

使用AAV9-Pcsk9-D377Y構(gòu)建動(dòng)物模型可以選擇聯(lián)合部分頸動(dòng)脈結(jié)扎術(shù)（PCL），快速誘導(dǎo)斑塊的形成，雖然說(shuō)動(dòng)脈粥樣硬化是是多種因素共同誘導(dǎo)的疾病，但是血流紊亂區(qū)域常常是動(dòng)脈粥樣硬化開(kāi)始發(fā)展的地方。這樣也使得小鼠的病變的位置變得可控，對(duì)模型的影響更加單一，減少其他因素的影響。部分頸動(dòng)脈結(jié)扎引起的動(dòng)脈粥樣硬化的分子機(jī)制與人動(dòng)脈粥樣硬化易發(fā)區(qū)域(如主動(dòng)脈弓小曲)觀察到的分子機(jī)制也是相同的。一般在病毒注射一周后，小鼠接受PCL手術(shù)（具體流程參考文獻(xiàn)PMID: 20613706），術(shù)后小鼠繼續(xù)HDF飼養(yǎng)3周后取材，評(píng)估研究對(duì)象對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化的影響。