來源??TMR Publishing Group作者??Traditional Medicine Research 編輯部??

鉤藤被廣泛用于治療肝風內動，驚癇抽搐，高熱驚厥。

鉤藤的主要化學成分有生物堿、三萜酸類、黃酮類、酚類和香豆素，其中生物堿是其重要的活性成分，且豐度較高，具有顯著的抗炎、降壓和抗神經(jīng)退行性作用。

中國科學院上海藥物研究所果德安教授團隊最新研究?Pseudotargeted metabolomics for exploring the changes of neurotransmitters profile in aging rat brain and the potential neuroprotective effect of alkaloids from Uncaria rhynchophylla.?Tradit Med Res. 2022;7(5):41. doi:10.53388/TMR20220303002?通過傳統(tǒng)藥理學結合擬靶向代謝組學手段對鉤藤生物堿的神經(jīng)保護作用進行了研究。

研究方法

使用20種不同的提取溶劑，采用液-液萃取（LLE）、蛋白沉淀（PPT）和固相萃?。⊿PE）等方法對大鼠腦組織中神經(jīng)遞質的提取方法進行優(yōu)化。利用UHPLC-MS/MS技術建立一種檢測腦組織中神經(jīng)遞質的擬靶向代謝組學方法，結合藥理學實驗評估鉤藤生物堿的神經(jīng)保護作用。

研究結果

提取方法的優(yōu)化

對比了LLE、PPT和SPE三種提取方法發(fā)現(xiàn)大多數(shù)神經(jīng)遞質可在SPE的清洗步驟中檢測到，因此SPE不適用于神經(jīng)遞質的提取。在LLE方法中，非極性萃取劑提取出的神經(jīng)遞質成分較少，而極性萃取劑(正丁醇和異丙醇)可以提取大部分神經(jīng)遞質成分。甲醇、乙腈以及不同比例的甲醇-乙腈混合溶劑作為蛋白質沉淀劑提取神經(jīng)遞質的能力很強，如圖1所示。通過比較各種神經(jīng)遞質對應的相對峰面積發(fā)現(xiàn)甲醇-乙腈(4:1,v/v)的PPT法表現(xiàn)出優(yōu)越的提取能力。

方法驗證

方法學驗證結果顯示線性、精密度和穩(wěn)定性均滿足擬靶向代謝組學的要求(表1)。在腦組織勻漿液中每種分析物均具有較好的線性(圖2)，且所有分析物的r2值均大于0.8,其中有71%的待測物超過0.95。此外，日內精度RSD為2.55% ~ 9.03%，日間精度RSD為2.02% ~ 12.55%，因此可認為日內和日間精確度符合實驗要求。穩(wěn)定性RSD為3.68%~9.24%，表明神經(jīng)遞質在24h內無明顯變化，待測物穩(wěn)定性符合實驗要求。

生物樣本分析

該研究測定了1月和8月鼠齡的大鼠腦組織樣本中神經(jīng)遞質的代謝譜。采用無監(jiān)督模式識別和有監(jiān)督模式識別(OPLS-DA)法進行統(tǒng)計分析，確定了7種差異性成分，即γ-氨基丁酸、亮氨酸、天冬氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、酪氨酸和色氨酸，這些差異性成分隨著大鼠年齡增長而增加。大鼠大腦中神經(jīng)遞質水平的變化情況如圖3所示。

腦組織中鉤藤生物堿分析

生物堿是鉤藤的主要活性成分，大鼠灌胃鉤藤水煎劑后，利用鉤藤生物堿對照品的質譜數(shù)據(jù)，在腦組織中鑒定出了7種生物堿，分別為鉤藤堿、異鉤藤堿、去氫鉤藤堿、異去氫鉤藤堿、毛鉤藤堿、去氫毛鉤藤堿和縫籽嗪甲醚。因此，可認為鉤藤生物堿可以穿過大鼠的血腦屏障。

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生物堿對谷氨酸（Glu）誘導的SH-SY5Y細胞活性的影響

通過細胞活力測定法評價生物堿對Glu誘導的SH-SY5Y細胞的神經(jīng)保護作用，如圖4所示，與對照組（相對細胞活性為100%）相比，Glu處理組的細胞活性顯著降低（42.37%±1.48%），而去氫毛鉤藤堿（84.63%±2.25%）、毛鉤藤堿（83.16%±3.26%）和縫籽嗪甲醚（92.06%±3.60%）則顯著提高了Glu誘導SH-SY5Y細胞的活性。

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生物堿對Glu誘導的SH-SY5Y細胞中ROS、SOD、MDA和GSH水平的影響

如圖5A所示，Glu導致SH-SY5Y細胞中ROS水平升高，而去氫毛鉤藤堿、毛鉤藤堿和縫籽嗪甲醚降低了Glu誘導的SH-SY5Y細胞中ROS水平。MDA、GSH和SOD的水平測定結果如圖5B-D所示，與陰性對照相比，Glu誘導后細胞內GSH和SOD水平顯著降低、MDA含量顯著升高，而去氫毛鉤藤堿、毛鉤藤堿和縫籽嗪甲醚干預Glu誘導的細胞后，細胞的MDA水平顯著降低、GSH和SOD的水平顯著升高，說明去氫毛鉤藤堿、毛鉤藤堿和縫籽嗪甲醚具有明顯的神經(jīng)保護作用。

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生物堿對Glu誘導的SH-SY5Y細胞蛋白表達的影響

如圖6所示，與陰性對照相比，Glu顯著提高了cleaved-caspase-3的表達水平，而去氫毛鉤藤堿、毛鉤藤堿和縫籽嗪甲醚降低了Glu誘導的SH-SY5細胞中cleaved-caspase-3的表達，說明生物堿對Glu誘導的興奮性神經(jīng)毒性具有保護作用。此外，這些生物堿還降低了Glu處理的SH-SY5細胞中p-ERK和p-p38的蛋白表達。結果表明，去氫毛鉤藤堿、毛鉤藤堿和縫籽嗪甲醚可通過ROS-MAPK/ERK信號通路有效地降低Glu誘導的細胞毒性和氧化損傷，可作為治療神經(jīng)性疾病的候選藥物。

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結論

本研究對神經(jīng)遞質的提取方法進行了系統(tǒng)的研究，認為甲醇-乙腈(4:1,v/v) PPT法對腦組織中神經(jīng)遞質具有較好的提取能力。建立了同時檢測26種神經(jīng)遞質的分析方法，在大鼠腦組織中共檢測到21種神經(jīng)遞質，其中7種氨基酸神經(jīng)遞質(天冬氨酸、酪氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、色氨酸、纈氨酸和γ-氨基丁酸)在1至8個月大鼠之間發(fā)生了顯著變化。對灌胃鉤藤水煎液后的大鼠腦組織進行分析，共檢測出了7種生物堿，確定了鉤藤中的生物堿能穿過血腦屏障。通過檢測Glu誘導的SH-SY5細胞中與氧化應激相關的因子的表達水平發(fā)現(xiàn)鉤藤生物堿可通過抑制氧化應激和凋亡途徑降低Glu誘導的SH-SY5Y細胞的興奮性神經(jīng)毒性，為鉤藤用于治療衰老相關疾病提供可靠依據(jù)。

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引用格式
Li SW, Wu YS, Wu SF, et al. Pseudotargeted metabolomics for exploring the changes of neurotransmitters profile in aging rat brain and the potential neuroprotective effect of alkaloids from Uncaria rhynchophylla. Tradit Med Res. 2022;7(5):41. doi:10.53388/TMR20220303002

傳統(tǒng)醫(yī)學研究 Traditional Medicine Research（ISSN 2413-3973）創(chuàng)刊于2016年，專注于發(fā)表具有明確歷史記載、民族特色和地域特色的傳統(tǒng)醫(yī)藥學研究和相關社會科學研究。目前已被Emerging Sources Citation Index (ESCI), 中科院期刊分區(qū), Embase, ProQuest 等數(shù)據(jù)庫收錄。

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