? 凝膠層析是依據(jù)分子大小這一物理性質(zhì)進(jìn)行分離純化的。層析過程如圖11 所示。凝膠層析的固定相是惰性的珠狀凝膠顆粒，凝膠顆粒的內(nèi)部具有立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，形成很多孔穴。當(dāng)含有不同分子大小的組分的樣品進(jìn)入凝膠層析柱后，各個(gè)組分就向固定相的孔穴內(nèi)擴(kuò)散，組分的擴(kuò)散程度取決于孔穴的大小和組分分子大小。比孔穴孔徑大的分子不能擴(kuò)散到孔穴內(nèi)部，完全被排阻在孔外，只能在凝膠顆粒外的空間隨流動(dòng)相向下流動(dòng)，它們經(jīng)歷的流程短，流動(dòng)速度快，所以首先流出；而較小的分子則可以完全滲透進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部，經(jīng)歷的流程長，流動(dòng)速度慢，所以最后流出；而分子大小介于二者之間的分子在流動(dòng)中部分滲透，滲透的程度取決于它們分子的大小，所以它們流出的時(shí)間介于二者之間，分子越大的組分越先流出，分子越小的組分越后流出。這樣樣品經(jīng)過凝膠層析后，各個(gè)組分便按分子從大到小的順序依次流出，從而達(dá)到了分離的目的。

(1) 凝膠顆粒???? (2) 小分子組分

(3) 中等分子組分?? (4)?大分子組分

(1) 完全排阻的大分子? ?(2) 中等分子

(3) 完全滲透的小分子? ?(4) 吸附分子

? 柱床體積Vt可以通過加入一定量的水至層析柱預(yù)定標(biāo)記處，然后測量水的體積來測定。外水體積Vo可以通過測定完全排阻的大分子物質(zhì)的洗脫體積來測定，一般常用藍(lán)色葡聚糖-2000作為測定外水體積的物質(zhì)。因?yàn)樗姆肿恿看螅?00萬），在各種型號的凝膠中都被排阻，并且它呈藍(lán)色，易于觀察和檢測。

? 2. 分配系數(shù)

? 分配系數(shù)是指某個(gè)組分在固定相和流動(dòng)相中的濃度比。對于凝膠層析，分配系數(shù)實(shí)質(zhì)上表示某個(gè)組分在內(nèi)水體積和在外水體積中的濃度分配關(guān)系。在凝膠層析中，分配系數(shù)通常表示為：? ? ??

前面介紹了Vt和Vo都是可以測定的，所以測定了某個(gè)組分的Ve就可以得到這個(gè)組分的分配系數(shù)。對于一定的層析條件，Vt和Vo都是恒定的，大分子先被洗脫出來，Ve值小，Kav值也小。而小分子后被洗脫出來，Ve值大，Kav值也大。對于完全排阻的大分子，Ve＝Vo，故Kav＝0。而對于完全滲透的大分子，Ve＝Vt，故Kav＝1。一般Kav值在0－1之間，如Kav值大于1，則表示這種物質(zhì)與凝膠有吸附作用。

對于某一型號的凝膠，在一定的分子量范圍內(nèi)，各個(gè)組分的Kav與其分子量的對數(shù)成線性關(guān)系：

Kav＝－b lg MW＋c? ?

其中b、c為常數(shù)，MW表示物質(zhì)的分子量。