LAPTM5 · 非酒精性脂肪肝炎

非酒精性脂肪肝炎（NASH）是發(fā)展為肝硬化和肝癌的主要原因，其病理特征是肝脂肪性病變、肝細胞氣球樣變、肝小葉和肝臟炎癥以及間質(zhì)纖維化。目前，預防和治療NASH的有效措施仍然有限，還沒有相應的治療藥物，因此尋找NASH的分子靶點也越來越受到重視。近年來，許多研究證明溶酶體調(diào)節(jié)著許多疾病的發(fā)生發(fā)展。其中溶酶體相關跨膜蛋白5（LAPTM5）是LAPTM家族成員之一，可作為一些疾病的干預靶點，例如通過調(diào)節(jié)MAPK信號通路的活性來改善心肌肥大。此外，MAPK信號通路的激活與NASH發(fā)生發(fā)展有著密切的關系。因此，作者綜合已有研究提出假設，即LAPTM5參與調(diào)控NASH的發(fā)生發(fā)展。

2023年5月8日，華中科技大學同濟醫(yī)學院夏家紅教授團隊在《nature communication》（IF=17.694）上發(fā)表了題為《Lysosomal-associated protein transmembrane 5 ameliorates non-alcoholic steatohepatitis by promoting the degradation of CDC42 in mice》的研究論文，本研究發(fā)現(xiàn)LAPTM5的表達水平與NASH呈負相關，這是由于NASH中高表達的NEDD4L介導LAPTM5泛素化降解。重要的是，作者闡明了LAPTM5對肝細胞的保護作用及其相關機制，為LAPTM5作為治療NASH的靶點提供了有力的依據(jù)。值得注意的是，作者使用了漢恒生物提供的腺病毒載體，成功在小鼠肝臟以及小鼠原代肝細胞中過表達LAPTM5，助力作者闡明LAPTM5抑制NASH發(fā)展的機制研究。

下面我們一起來看看作者是如何挖掘其中的機制：

一 、

LAPTM5 在脂肪肝中表達下調(diào)并與 NASH進展相關

科學研究已發(fā)現(xiàn)有大量蛋白質(zhì)參與調(diào)節(jié)NASH。為了解NASH發(fā)病機制中最關鍵的蛋白質(zhì)，作者從NASH患者的肝臟樣本中搜索了10個RNA-seq臨床數(shù)據(jù)庫，最終發(fā)現(xiàn)NASH嚴重程度與溶酶體相關蛋白表達的關系最為密切（圖1 a-d）。另外，5個小鼠肝臟RNA-seq數(shù)據(jù)庫的檢索結果也證實了這一結論（圖1 e）。作者對上述鑒定出的71種溶酶體跨膜蛋白進行了高內(nèi)涵篩選分析，以評估這些基因?qū)χ|(zhì)譜的影響，結果顯示LAPTM5對棕櫚酸（PA）刺激后肝細胞脂質(zhì)蓄積具有最強的抑制作用（圖1 f）。為了研究LAPTM5和NASH之間的相關性，作者檢測了非脂肪變性和NASH患者肝臟LAPTM5的表達水平，結果發(fā)現(xiàn)NASH患者肝臟中LAPTM5表達水平明顯低于非脂肪變性患者，且與NASH的分級評分呈負相關（圖1 g-i）。與正常飲食的ob/ob小鼠和野生型小鼠相比，進行高脂飲食、高膽固醇飲食或缺乏蛋氨酸和膽堿飲食的兩種小鼠的肝臟中，LAPTM5表達均顯著減少，這與人類患者觀察到的結果一致（圖1 j）。總之，LAPTM5表達水平與NASH呈負相關關系，提示LAPTM5能夠延緩病情發(fā)展。

圖1. LAPTM5在脂肪肝中表達下調(diào)，并與NASH進展相關

二 、

NEDD4L通過催化其K48連接的泛素化介導LAPTM5的蛋白降解

作者進一步探討了NASH中LAPTM5下調(diào)的機制。胞內(nèi)蛋白的降解可以通過泛素—蛋白酶體系統(tǒng)或自噬途徑，使用PA刺激肝細胞并以不同途徑的抑制劑來干預，發(fā)現(xiàn)蛋白酶抑制劑MG132阻斷了LAPTM5的降解，而溶酶體抑制劑Chlq未能起到作用（圖2 a，b）。接著IP-質(zhì)譜檢測發(fā)現(xiàn)NEDD4L、NEDD4、WWP2和ITCH可能參與LAPTM5的降解（圖2 c）。通過CO-IP和GST沉淀分析表明，LAPTM5與NEDD4L之間具有較強的相互作用，且NEDD4L過表達可促進LAPTM5降解（圖2 d-g）。然后，作者研究了NEDD4L促進LAPTM5降解的機制。檢測了LAPTM5的泛素化情況，結果顯示NEDD4L通過K48連接使LAPTM5泛素化，并由E3連接酶促進其降解（圖2 h-m）。此外，還發(fā)現(xiàn)NEDD4L的表達在NASH中顯著上調(diào)，證明NEDD4L也受到NASH的調(diào)控。

圖2. NEDD4L通過催化其K48連接的泛素化來介導

LAPTM5的蛋白質(zhì)降解。

三 、

LAPTM5抑制肝細胞的脂質(zhì)蓄積和炎癥

為了研究LAPTM5對肝細胞脂質(zhì)代謝和炎癥的影響，作者從Laptm5-KO小鼠和Laptm5-Flox對照小鼠中分離出原代肝細胞，這些細胞在體內(nèi)已感染了LAPTM5過表達腺病毒（圖3 a）。尼羅紅染色結果顯示，與對照組相比，Laptm5-KO組小鼠中PAOA明顯加劇了肝細胞的脂質(zhì)蓄積，并伴有甘油三酯（TG）和總膽固醇（TC）的升高，而Laptm5過表達改善了這一現(xiàn)象（圖3 b，c）。此外，qPCR和WB結果進一步證實了LAPTM5對脂質(zhì)代謝和炎癥的抑制作用（圖3 d-g）。再根據(jù)RNA-seq數(shù)據(jù)進行層次聚類分析，清晰地將PAOA處理的樣本分為兩個亞組：Laptm5-Flox-PAOA和Laptm5-KO-PAOA（圖3 h）。值得注意的是，Laptm5敲除促進與脂代謝和炎癥相關的生物學過程（圖3 i-k）?？傊?，這些體外數(shù)據(jù)表明LAPTM5可以拮抗代謝應激誘導的肝細胞脂質(zhì)蓄積和炎癥。

圖3. Laptm5-KO可加重肝細胞內(nèi)的脂質(zhì)堆積和炎癥

四 、

肝細胞特異性缺失LAPTM5會加劇脂肪性肝炎

接著作者探討了LAPTM5對脂肪性肝炎及其并發(fā)癥的影響。作者構建了肝細胞特異性Laptm5敲除（Laptm5-HKO）小鼠（圖4 a），并用正常飼料或高脂飼料（HFD）喂養(yǎng)24周。正常飲食的Laptm5-HKO小鼠和Laptm5-Flox小鼠在體重、肝臟重量和血脂方面沒有差異；而HFD飲食組中，Laptm5-HKO小鼠的體重、肝臟重量、空腹血糖以及肝臟和血清中的TG/TC均高于對照組，且肝臟出現(xiàn)嚴重的脂肪堆積，與脂質(zhì)攝?。–D36）和合成（FASN、SCD1、PPARG和Srebf1）相關的基因表達上調(diào)（圖4 b-m）。此外，與對照組相比，Laptm5-HKO小鼠中丙氨酸轉移酶（ALT）和天冬氨酸轉移酶（AST）均顯著升高，表明肝臟受到了嚴重的損傷。因此，LAPTM5的特異性缺失進一步加劇了NAFLD（非酒精性脂肪肝?。┑陌l(fā)展。

圖4. Laptm5-HKO 加劇了HFD誘導的肝脂肪變性

作者為了探討LAPTM5在NASH小鼠模型中的作用，用高脂和高膽固醇（HFHC）飼料喂養(yǎng)Laptm5-HKO和Laptm5-Flox小鼠16周。8周后，Laptm5-HKO小鼠的肝臟重量和空腹血糖等脂代謝指標以及脂質(zhì)蓄積增加，16周時會進一步惡化，并且炎癥和肝纖維化也會隨之加重，血清ALT和AST升高（圖5 a-j）。作者發(fā)現(xiàn)，在NASH中肝臟LAPTM5缺失會促進脂代謝、炎癥和纖維化的多種途徑和基因上調(diào)（圖5 k-n）?？偠灾琇APTM5缺乏加重了小鼠的NASH。

圖5. Laptm5-HKO 加劇了HFHC誘導的NASH

五、

肝臟特異性過表達LAPTM5可減輕HFHC誘導的NASH

為了證實肝臟LAPTM5在NASH發(fā)病機制中的作用，作者構建了肝細胞特異性過表達Laptm5轉基因（Laptm5-HTG）小鼠模型（補充圖7 a，b），以同窩小鼠（NTG）作為對照。在HFHC喂養(yǎng)16周后，與NTG小鼠相比，Laptm5-HTG小鼠的肝臟重量較小、HFHC誘導的高血糖和惡化的脂代謝得到緩解、肝脂肪變性更輕并減輕了NASH期間的炎癥、纖維化和肝損傷（補充圖7 c-p）。以上結果表明，LAPTM5可以預防脂肪性肝炎及其代謝相關的并發(fā)癥。

補充圖 7. 肝細胞特異性LAPTM5過表達減輕HFHC誘導的NASH

六 、

LAPTM5通過促進CDC42的溶酶體降解來抑制MAPK信號通路的激活

為了研究LAPTM5抑制NASH的機制， 作者通過RNA測序和KEGG分析等實驗結果發(fā)現(xiàn)，LAPTM5與MAPK信號通路相關，且呈負相關（圖6 a-e）。接著發(fā)現(xiàn)LAPTM5與小GTP結合蛋白CDC42（細胞分裂周期蛋白42）相互作用（圖6 f），CDC42過表達顯著加重了脂質(zhì)蓄積、炎癥反應且促進了肝細胞中MAPK信號的激活。隨后，CO-IP和GST測定證實了LAPTM5和CDC42之間存在相互作用，且LAPTM5過表達抑制了PA誘導下CDC42的表達，LAPTM5敲除則反之（圖6 g-l）。此外，與非NASH患者相比，NASH患者肝組織中CDC42表達明顯上調(diào)，進一步說明LAPTM5與CDC42呈負相關（圖6 m）。通過MG132和Chlq處理LAPTM5過表達的肝細胞，發(fā)現(xiàn)溶酶體抑制劑Chlq可以消除LAPTM5對CDC42的抑制作用（圖6 n，o）；并且在PA處理后，CDC42逐漸向溶酶體移動，最終與LAPTM5過表達細胞中的溶酶體共定位，結果表明LAPTM5促進了CDC42向溶酶體轉運從而將其降解（圖6 p）。

圖6. LAPTM5通過促進CDC42的溶酶體降解來抑制MAPK信號通路

的激活

七 、

CDC42介導LAPTM5對肝細胞脂質(zhì)蓄積和炎癥的影響

接下來，作者驗證了LAPTM5-CDC42軸是否存在于NASH中。作者發(fā)現(xiàn)，在LAPTM5過表達的肝細胞中過表達CDC42消除了LAPTM5對脂代謝應激的抑制、上調(diào)了MAPK信號通路（圖7 a-d）。相反，敲除LAPTM5后再敲低CDC42，則抑制了肝細胞的脂質(zhì)蓄積和炎癥反應（圖7 e-h）。這些結果表明，LAPTM5通過介導CDC42的降解來延緩NASH的發(fā)展。

圖7. CDC42 介導了LAPTM5對肝細胞脂質(zhì)沉積和炎癥的影響

八 、

腺病毒介導的肝臟LAPTM5過表達減輕了非酒精性脂肪肝炎

最后，作者探討了靶向LAPTM5-CDC42軸對NASH的治療效果。將過表達LAPTM5的腺病毒（Ad-LAPTM5）注射到已接受8周HFHC飲食的小鼠體內(nèi)，再進行HFHC喂養(yǎng)4周，以Ad-GFP作為對照（圖8 a）。結果發(fā)現(xiàn)，與Ad-GFP相比，LAPTM5過表達下調(diào)了小鼠肝臟中p-JNK1/2和CDC42的表達，空腹血糖、肝臟重量和肝臟重量與體重的比值也顯著降低，改善了肝臟的脂質(zhì)蓄積、炎癥和肝損傷（圖8 b-m）。以上結果表明，LAPTM5作為靶點在治療NASH和代謝紊亂中具有良好的前景。

圖8. 腺病毒介導的LAPTM5過表達減輕了非酒精性脂肪性肝炎

綜上所述，LAPTM5可在代謝應激下被NEDD4L泛素化降解。LAPTM5過表達減輕了肝的脂肪性病變、炎癥反應以及纖維化。從機制上看，LAPTM5可直接與CDC42結合，促進其進入溶酶體降解，以抑制p38/c-JNK通路的激活，從而發(fā)揮保護肝細胞的功能。因此，靶向肝細胞LAPTM5可成為治療NASH的有效方案，值得進行進一步的臨床研究。