? ? 既然如此，小云今天就借這篇5分+的生信文章，跟你說說生信分析是如何助力課題設(shè)計的，只需3步就能得到關(guān)鍵免疫細(xì)胞和關(guān)鍵基因：

1)?分析免疫細(xì)胞浸潤，選擇關(guān)鍵免疫細(xì)胞進(jìn)行分組；

2)?分析組間差異表達(dá)基因，選擇與免疫細(xì)胞最相關(guān)的關(guān)鍵基因；

3)?單細(xì)胞數(shù)據(jù)分析關(guān)鍵基因的細(xì)胞定位。

題目：CA9相關(guān)的酸性微環(huán)境介導(dǎo)CD8+T細(xì)胞相關(guān)的胰腺癌免疫抑制

雜志：Frontiers in oncology

影響因子：5.738

發(fā)表時間：2022年1月

? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 數(shù)據(jù)信息

數(shù)據(jù)集/隊列? ? ? ? ? ? ? ? 數(shù)據(jù)庫? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ??? ? ? ? ? ??數(shù)據(jù)類型? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?樣本信息

TCGA-胰腺癌? ? ? ? ? ? ?TCGA? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?RNA-seq數(shù)據(jù)? ? ? ? ? ? ? ?154個胰腺癌樣本CRA001160? ? ? ? ? ? ? ? Genome Sequence Archive? ??scRNA-seq數(shù)據(jù)? ? ? ??單細(xì)胞RNA-seq數(shù)據(jù)

GSE131050? ? ? ? ? ? ? ? GEO? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ??芯片數(shù)據(jù)? ? ? ? ? ? ? ? ? ?47個胰腺癌樣本

? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 研究思路

? ? 對TCGA胰腺癌數(shù)據(jù)進(jìn)行CIBERSORT分析，篩選與胰腺癌患者預(yù)后相關(guān)的免疫細(xì)胞--CD8+T細(xì)胞。按CD8+T細(xì)胞浸潤水平分組，篩選與CD8+T細(xì)胞顯著負(fù)相關(guān)的差異表達(dá)基因--碳酸酐酶9 (CA9)。單細(xì)胞數(shù)據(jù)分析確定CA9主要表達(dá)在腫瘤細(xì)胞中。根據(jù)CA9的表達(dá)水平將患者分成高表達(dá)組和低表達(dá)組，分析CA9與胰腺癌患者預(yù)后、免疫檢查點、腫瘤突變負(fù)荷（TMB）和鐵死亡基因的相關(guān)性。通過實驗驗證CA9抑制劑的作用。

? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?主要研究結(jié)果

1.?CD8+T細(xì)胞與胰腺癌的預(yù)后不良相關(guān)

CIBERSORT分析TCGA胰腺癌數(shù)據(jù)中免疫細(xì)胞浸潤情況，其中CD8+T細(xì)胞低浸潤水平與胰腺癌預(yù)后不良顯著相關(guān)。還發(fā)現(xiàn)單核細(xì)胞和M0巨噬細(xì)胞與患者預(yù)后相關(guān)。

2.?篩選與CD8+T細(xì)胞浸潤相關(guān)的關(guān)鍵基因CA9

根據(jù)CD8+T細(xì)胞的浸潤水平，將患者分成CD8+T細(xì)胞高浸潤組和低浸潤組，分析兩組間的差異表達(dá)基因（DEGs）。并對DEGs進(jìn)行GO和KEGG分析。

? ? 其中CA9表達(dá)與CD8+T細(xì)胞浸潤比例呈顯著負(fù)相關(guān)。GEO數(shù)據(jù)集驗證了這一結(jié)果。

3.?單細(xì)胞數(shù)據(jù)分析確定CA9的細(xì)胞定位

分析scRNA-seq數(shù)據(jù)集CRA001160，結(jié)果顯示CA9主要在胰腺癌細(xì)胞中表達(dá)，腫瘤細(xì)胞中CA9的表達(dá)與CD8+T細(xì)胞浸潤有關(guān)。

4.?CA9表達(dá)與胰腺癌患者預(yù)后相關(guān)

? ? 對TCGA胰腺癌數(shù)據(jù)進(jìn)行KM生存分析，發(fā)現(xiàn)CA9低表達(dá)的患者比CA9高表達(dá)的患者有更好的OS。然后根據(jù)CA9的表達(dá)水平計算每個樣本的風(fēng)險評分，進(jìn)行時間依賴性受試者工作特征(ROC)分析，生存期1年、3年、5年風(fēng)險評分的ROC曲線下面積(AUC)分別為0.603、0.563、0.742。提示用CA9表達(dá)水平預(yù)測胰腺癌預(yù)后是可靠的。

5.?分析CA9與免疫檢查點、腫瘤突變負(fù)荷(TMB)和鐵死亡相關(guān)基因的相關(guān)性

分析CA9高表達(dá)組和低表達(dá)組免疫檢查點分子的表達(dá)，以及CA9與腫瘤突變負(fù)擔(dān)(TMB)、鐵死亡相關(guān)mRNA和m6A相關(guān)mRNA的相關(guān)性。發(fā)現(xiàn)胰腺癌患者CA9與TMB評分呈正相關(guān)。顯著差異表達(dá)的鐵死亡基因包括CDKN1A、GPX4等。

6.?實驗驗證CA9抑制劑對腫瘤、酸性微環(huán)境和CD8+T細(xì)胞的作用

CA9是碳酸酐酶(CA)家族成員，CA9催化二氧化碳生成碳酸氫鹽離子和質(zhì)子，細(xì)胞膜的CA9是腫瘤pH調(diào)節(jié)機(jī)制的重要組成部分。因此檢測了對酸性微環(huán)境的影響。

? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 小云有話說

這篇文章通過3步分析就得到了關(guān)鍵免疫細(xì)胞和關(guān)鍵基因：

1)?分析免疫細(xì)胞浸潤，選擇關(guān)鍵免疫細(xì)胞（CD8+T細(xì)胞）進(jìn)行分組；

2)?分析組間差異表達(dá)基因，選擇與免疫細(xì)胞顯著負(fù)相關(guān)的關(guān)鍵基因CA9進(jìn)行分析；

3)?利用單細(xì)胞數(shù)據(jù)分析關(guān)鍵基因的細(xì)胞定位，主要定位于腫瘤細(xì)胞。

后面就是針對關(guān)鍵基因進(jìn)行的一些常規(guī)分析，證明CA9與預(yù)后、免疫檢查點等的相關(guān)性，還分析了CA9與鐵死亡基因、m6A基因的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)幾個鐵死亡基因差異表達(dá)，這也為后續(xù)課題初步篩選了潛在的方向，比如可以設(shè)計“CA9通過鐵死亡影響酸性微環(huán)境，抑制CD8+T細(xì)胞的功能”等課題思路。

看完小云的分析，是不是覺得用生信分析助力課題設(shè)計的方法很好用呢？

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