裂解和溶解：

為了使蛋白質(zhì)能夠進(jìn)入分離凝膠，它們必須是可溶的形式。樣品制備的階段是裂解。

通過(guò)裂解提取細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的蛋白質(zhì)，裂解會(huì)破壞細(xì)胞的質(zhì)膜和/或細(xì)胞壁，以釋放蛋白質(zhì)。細(xì)胞外表達(dá)（分泌）的蛋白質(zhì)不需要裂解，盡管可以對(duì)細(xì)胞進(jìn)行處理和加載以觀察由于合成不當(dāng)而捕獲的任何蛋白質(zhì)。

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Jackson公司大規(guī)模蛋白質(zhì)純化——提取方法：

可以通過(guò)蛋白質(zhì)印跡分析來(lái)自各種來(lái)源的蛋白質(zhì)。樣品可能來(lái)自蛋白質(zhì)表達(dá)系統(tǒng)，例如哺乳動(dòng)物或細(xì)菌細(xì)胞培養(yǎng)物，或來(lái)自臨床組織樣品，每種都需要不同的處理來(lái)產(chǎn)生有用的印跡。

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用于蛋白質(zhì)提取的方法取決于樣品的性質(zhì)。蛋白質(zhì)表達(dá)在哺乳動(dòng)物、昆蟲(chóng)、細(xì)菌和酵母等不同類型的細(xì)胞中進(jìn)行，一些樣本可能來(lái)自組織；這些具有需要不同處理的結(jié)構(gòu)特性。

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分泌蛋白：

在哺乳動(dòng)物或昆蟲(chóng)細(xì)胞系統(tǒng)中表達(dá)的一些蛋白質(zhì)也可能在上清液中表達(dá)，不需要從細(xì)胞中提取。一個(gè)好的提示是保留上清液樣本，并在篩選表達(dá)時(shí)將其加載到細(xì)胞裂解液旁邊的凝膠上。

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Jackson公司篩選和處理：

蛋白質(zhì)表達(dá)通常通過(guò)蛋白質(zhì)印跡進(jìn)行篩選。例如，幾個(gè)克隆的表達(dá)可以相互比較，或者它們?cè)诓煌磉_(dá)系統(tǒng)中的表達(dá)。在這些篩選試驗(yàn)中，從蛋白質(zhì)制備物中取出樣品并上樣用于分析。通常這會(huì)將上清液與細(xì)胞沉淀進(jìn)行比較，以定位表達(dá)發(fā)生的位置。考馬斯染色觀察到的總蛋白質(zhì)可以與蛋白質(zhì)印跡中特異性提取的感興趣蛋白質(zhì)的表達(dá)進(jìn)行比較。

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篩選試驗(yàn)中進(jìn)行的基本處理可能不能代表最終表達(dá)（prep）是如何處理以供最終使用的，例如晶體學(xué)試驗(yàn)所需的仔細(xì)純化步驟。

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圖?1：在一系列細(xì)胞裂解物中檢測(cè)?His?標(biāo)簽蛋白。以?100 ng?的濃度將?C?末端?His-Tagged?蛋白添加到細(xì)胞裂解物中。HEK 293、CHO、BL21大腸桿菌和?Sf9?昆蟲(chóng)細(xì)胞的細(xì)胞裂解物被還原并在?100°C?下煮沸?5?分鐘，并以?9?μg/孔的速度加載到串聯(lián)?SDS?凝膠中。

A.?蛋白質(zhì)印跡。將凝膠電印跡到硝酸纖維素膜上，用?PBS/0.2% Tween 20?中的?5% BSA?封閉，并用?Jackson ImmunoResearch?的?HRP Rabbit Anti-His Tag ( 300-035-240 )?以?1:20K?稀釋度進(jìn)行探測(cè)，并使用數(shù)字成像儀進(jìn)行可視化。

B.?凝膠用考馬斯染色。

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Jackson公司裂解緩沖液：

裂解緩沖液的目的是破壞細(xì)胞膜以釋放蛋白質(zhì)。裂解緩沖液通常包括破壞細(xì)胞膜脂質(zhì)雙層并形成膠束的去污劑。有許多緩沖液配方已經(jīng)過(guò)驗(yàn)證，可用于不同的細(xì)胞類型或蛋白質(zhì)表達(dá)位置，例如含有去污劑的?RIPA?或?NP-40。材料的加工應(yīng)在冰上進(jìn)行，以盡量減少可能改變蛋白質(zhì)的細(xì)胞成分的降解和變性。

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蛋白酶及其抑制：

溶解方法，例如涉及對(duì)細(xì)胞進(jìn)行機(jī)械破壞的過(guò)程，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)蛋白酶的釋放。這些蛋白酶可以消化和截?cái)喔信d趣的蛋白質(zhì)，這可能會(huì)導(dǎo)致在印跡上觀察到多個(gè)條帶。

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蛋白質(zhì)對(duì)蛋白酶的敏感性取決于其氨基酸組成，細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的抵抗力低于細(xì)胞表面或細(xì)胞外蛋白質(zhì)。當(dāng)被去污劑溶解時(shí)，膜蛋白特別容易被蛋白酶降解。生物信息學(xué)工具可用于提前預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)對(duì)蛋白水解的敏感性。蛋白酶抑制劑可用于防止蛋白水解；這些可以是化學(xué)和酶抑制劑的混合物，可以在添加到細(xì)胞或要儲(chǔ)存蛋白質(zhì)的緩沖液之前添加到裂解緩沖液中。

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有一系列抑制劑可以阻止常見(jiàn)的絲氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶以及氨肽酶和金屬蛋白酶。不同的表達(dá)系統(tǒng)或?qū)Φ鞍踪|(zhì)活性抑制的敏感性可能會(huì)阻止某些抑制劑的使用。蛋白酶抑制劑的專有混合物通常是可用的，或者可以使用單一試劑。

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可以在緩沖液中小心使用疊氮化物以防止細(xì)菌生長(zhǎng)，細(xì)菌也可能是蛋白酶的來(lái)源。細(xì)胞裂解后可能會(huì)發(fā)生去磷酸化。如果磷酸化蛋白質(zhì)是蛋白質(zhì)印跡的目標(biāo)，則磷酸酶抑制劑（如釩酸鈉）也應(yīng)添加到裂解緩沖液中。在整個(gè)樣品制備過(guò)程中，樣品應(yīng)保持在冰上，以盡量減少降解和去磷酸化的可能性。（表1）

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Jackson公司專注于親和純化的二抗和純化免疫球蛋白研究，服務(wù)領(lǐng)域覆蓋各大學(xué)科研所和醫(yī)院里的動(dòng)物研究以及生物醫(yī)學(xué)研究機(jī)構(gòu)的科學(xué)家。艾美捷科技是Jackson公司的中國(guó)代理商，為科研工作者提供優(yōu)質(zhì)的產(chǎn)品與服務(wù)。