酵母菌，實(shí)際上是一些單細(xì)胞真菌的統(tǒng)稱，在自然界中分布廣泛。其中有很多種屬已被成功用于外源基因的表達(dá)和研究。它不僅集合了原核表達(dá)系統(tǒng)培養(yǎng)方便、經(jīng)濟(jì)實(shí)用、易于大規(guī)模發(fā)酵等優(yōu)點(diǎn)，而且還具備真核表達(dá)系統(tǒng)蛋白翻譯后修飾的功能。今天AtaGenix這位老司機(jī)將帶你熟悉我們擁有的釀酒酵母和畢赤酵母兩套蛋白表達(dá)系統(tǒng)，讓你在重組蛋白的道路上越走越遠(yuǎn)。

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釀酒酵母

釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），在傳統(tǒng)工藝中是面包師和釀酒師們的魔法棒，在現(xiàn)代技術(shù)中則變身為科學(xué)家們的實(shí)力寵兒。它是酵母菌中最早用于基因克隆和表達(dá)的宿主，于1996年其全基因組測序工作完成，遺傳背景清晰。該表達(dá)系統(tǒng)主要有兩種類型的載體，包括整合型載體和附加型載體。

整合型載體不含酵母DNA復(fù)制起始區(qū)，不能在酵母細(xì)胞內(nèi)自主復(fù)制。表達(dá)載體轉(zhuǎn)到酵母細(xì)胞后借助其上的整合區(qū)元件與宿主染色體發(fā)生同源重組，隨染色體復(fù)制而進(jìn)行復(fù)制和表達(dá)。穩(wěn)定性高，只是拷貝數(shù)低下。像AtaGenix擁有的pATX3載體則將整合區(qū)設(shè)定在釀酒酵母核糖體DNA（rDNA）基因簇上，轉(zhuǎn)化重組后可以得到多個整合拷貝，在數(shù)量上占有優(yōu)勢。

附加型載體則是以其自身來源的2μ質(zhì)粒作為出發(fā)質(zhì)粒衍生出的多種表達(dá)載體。這類載體在酵母細(xì)胞內(nèi)本身擁有獨(dú)立自主復(fù)制的能力，常以30或更多拷貝數(shù)存在。AtaGenix的pYES2-NTA就是這種類型的表達(dá)載體，可使外源基因得到有效表達(dá)。

通常釀酒酵母宿主菌是各式各樣的營養(yǎng)缺陷型（如his3-，leu-，trp-，ura3-等）酵母菌，能適用于不同載體的轉(zhuǎn)化篩選。但是在表達(dá)外源蛋白時，常會出現(xiàn)載體丟失、蛋白產(chǎn)物不均一、過度糖基化、不易積累以及副產(chǎn)物產(chǎn)生乙醇等問題。不過由于其遺傳操作簡單，可同時容納不同的2μ質(zhì)粒，釀酒酵母現(xiàn)在常用于真核基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的研究如酵母雙雜交，蛋白相互作用等方面。通過模擬酵母染色體復(fù)制功能元件，能夠構(gòu)建大片段序列克隆系統(tǒng)——酵母人工染色體（YAC）。還有近年來發(fā)展起來的酵母表面展示等技術(shù)，使它在生命科學(xué)的舞臺上又一次煥發(fā)出絢麗光彩。

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畢赤酵母

畢赤酵母（Pichia pastoris）是繼釀酒酵母后，于上世紀(jì)80年代初開發(fā)出來的的第二代酵母表達(dá)系統(tǒng)。它屬于一種甲醇營養(yǎng)型酵母菌，擁有的專屬強(qiáng)有力AOX（醇氧化酶基因）啟動子，可嚴(yán)格調(diào)控外源基因表達(dá)，進(jìn)行高密度發(fā)酵。作為二代系列，它不但繼承了初代成本低、周期短、能進(jìn)行蛋白糖基化、磷酸化、酰脂化等翻譯后加工修飾等優(yōu)點(diǎn)，而且避免了表達(dá)載體不穩(wěn)定、誘導(dǎo)不嚴(yán)謹(jǐn)?shù)热毕?，能夠表達(dá)出有生物活性的蛋白，是表達(dá)真核來源蛋白的理想菌株。

但是在用二代酵母表達(dá)外源蛋白時，面臨和出現(xiàn)的問題也較多：如何選擇合適的表達(dá)載體，酵母轉(zhuǎn)化不成功，無法鑒定到陽性克隆，蛋白不表達(dá)，表達(dá)過程中出現(xiàn)污染，表達(dá)量低等等。AtaGenix認(rèn)為要解決以上問題可從以下幾個方面進(jìn)行考慮：

首先，需要分析和優(yōu)化所要表達(dá)的基因序列。當(dāng)基因中AT含量高時有可能造成轉(zhuǎn)錄提前終止，因為AT豐富區(qū)可能存在轉(zhuǎn)錄提前終止信號，適當(dāng)保持AT 含量在30%～55% 范圍內(nèi)是有必要的；基因的二級結(jié)構(gòu)如發(fā)卡結(jié)構(gòu)也是一個重要影響因素；同時畢赤酵母有密碼子偏愛性。一套好的基因優(yōu)化系統(tǒng)是從多個方面進(jìn)行綜合評估的。

其次，選擇胞內(nèi)表達(dá)還是分泌表達(dá)是由外源蛋白自身理化特點(diǎn)決定的。畢赤酵母由于無內(nèi)源性質(zhì)粒，無論是胞內(nèi)還是分泌表達(dá)，載體都屬于整合型表達(dá)載體。外源蛋白的空間構(gòu)象（二三級結(jié)構(gòu)）、糖基化位點(diǎn)、水溶性、氨基酸組成、二硫鍵復(fù)雜程度以及其他的理化特點(diǎn)都會影響畢赤酵母對蛋白的分泌。蛋白過大或二硫鍵過多都不利于蛋白的分泌表達(dá)。而且目的基因中也不能含有畢赤酵母的Kex2酶降解位點(diǎn)（連續(xù)兩個堿性氨基酸，如能夠識別和水解lys-Arg-C端）。AtaGenix擁有各種胞內(nèi)表達(dá)和胞外表達(dá)載體，可滿足客戶不同層次的需求。

再次，良好的實(shí)驗操作習(xí)慣、豐富的實(shí)驗操作技巧、成熟的理論規(guī)范都是外源蛋白成功表達(dá)不可或缺的條件。雖然網(wǎng)絡(luò)上有詳細(xì)全面的有關(guān)畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)的資源，但AtaGenix擁有的豐富實(shí)戰(zhàn)經(jīng)驗，如高效的畢赤酵母感受態(tài)細(xì)胞制備，簡便的pcr陽性克隆驗證方法，高通量的表達(dá)測試，嚴(yán)格的無菌操作規(guī)范等則是我們的客戶能實(shí)實(shí)在在感受到的。

最后，提高蛋白在酵母系統(tǒng)中的表達(dá)量有很多種方法。DNA-轉(zhuǎn)錄-翻譯-翻譯后加工整個表達(dá)環(huán)節(jié)都能影響外源蛋白的表達(dá)。分析外源蛋白性質(zhì)、構(gòu)建多拷貝質(zhì)粒（基因串聯(lián)表達(dá)、重復(fù)轉(zhuǎn)化等）、選擇不同種類的啟動子（pAOX、pGAP 等）、采用不同信號肽（載體信號肽或自身信號肽）、增加產(chǎn)物穩(wěn)定性（培養(yǎng)基中加PMSF，蛋白水解物等）、優(yōu)化培養(yǎng)和誘導(dǎo)條件（誘導(dǎo)起始菌體濃度、誘導(dǎo)時間、不同劑量誘導(dǎo)劑等）都可以在不同程度上改變蛋白的表達(dá)量。這些因素在蛋白表達(dá)的不同時空環(huán)節(jié)主導(dǎo)地位是不同的，如初期可能是基因劑量（多拷貝）起決定作用；當(dāng)?shù)鞍妆磉_(dá)水平提高到一定程度后，酵母細(xì)胞的分泌折疊能力會成為關(guān)鍵因素；到了后期，蛋白的穩(wěn)定性則成為主要限制因素。因此，獲得蛋白的最佳表達(dá)條件需要各個環(huán)節(jié)各種條件的綜合優(yōu)化。

其實(shí)，無論哪種表達(dá)系統(tǒng)，提高表達(dá)量和優(yōu)化表達(dá)條件都遵循以上原則，而酵母表達(dá)系統(tǒng)由于其在真核界中的優(yōu)勢地位而被廣泛應(yīng)用。相信AtaGenix據(jù)此開發(fā)和改良出的獨(dú)特酵母表達(dá)平臺（如酵母糖基人源化途徑改造）必能在眾多系統(tǒng)中脫穎而出，貢獻(xiàn)出更多優(yōu)質(zhì)蛋白，將您的實(shí)驗煩惱一掃而光。

The end