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在過(guò)去的二十幾年的時(shí)間里，對(duì)miRNA的研究呈現(xiàn)爆炸式的增長(zhǎng)，miRNA從“生物垃圾”搖身一變成為“年度分子”，該領(lǐng)域的研究也成為近期最熱門(mén)的生物學(xué)課題之一。研究miRNA，經(jīng)常會(huì)涉及到miRNA和下游靶向基因互作，今天我們就為大家介紹一種常用于研究miRNA和下游靶向基因互作的技術(shù)——雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)。

雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)原理

利用熒光素酶與底物結(jié)合發(fā)生化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的特性，在螢火蟲(chóng)熒光素酶（firefly luciferase）的上游的3’UTR區(qū)域插入待驗(yàn)證的靶序列，構(gòu)建成熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒。然后轉(zhuǎn)染細(xì)胞，適當(dāng)刺激或處理后裂解細(xì)胞，測(cè)定熒光素酶活性。通過(guò)熒光素酶活性的高低判斷刺激前后或不同刺激對(duì)感興趣的調(diào)控元件的影響。

海腎熒光素酶（Renilla luciferase或R-Luc）以腔腸素（coelenterazine）為底物，在氧分子存在的條件下催化coelenterazine氧化生成coelenteramide，此過(guò)程中發(fā)出最強(qiáng)波長(zhǎng)在465nm左右的生物熒光。R-Luc通常由固定組成型啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)，在報(bào)告系統(tǒng)中作為校正input誤差的內(nèi)參信號(hào)。

在測(cè)量過(guò)程中，首先加入熒光素酶檢測(cè)試劑Luciferase Assay Reagent II產(chǎn)生螢火蟲(chóng)熒光信號(hào)，測(cè)量螢火蟲(chóng)熒光素酶活性。定量螢火蟲(chóng)熒光強(qiáng)度之后，再在同一樣品中加入Stop&Glo Reagent試劑，將上述反應(yīng)淬滅，并同時(shí)啟動(dòng)海腎熒光素酶反應(yīng)，進(jìn)行第二次測(cè)量，稱(chēng)之為雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)。

研究miRNA的靶基因?qū)嶒?yàn)時(shí)，使用雙熒光素酶質(zhì)粒情況

兩種熒光素酶分別位于兩個(gè)載體上，一般會(huì)涉及到三種質(zhì)粒：

報(bào)告基因質(zhì)粒：用于插入miRNA靶序列

內(nèi)參質(zhì)粒：表達(dá)海腎熒光素酶

轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)質(zhì)粒：micRNA

兩種熒光素酶位于同一個(gè)載體上, 現(xiàn)在的這類(lèi)質(zhì)粒比較有名的是Promega公司的pmirGLO質(zhì)粒（見(jiàn)圖1）。從圖中可以看到海腎熒光素酶和螢火蟲(chóng)熒光素酶在同一個(gè)載體上。

案例分享

題目：Loss of miR-26b-5p promotes gastric cancer progression via
miR-26b-5p-PDE4B/CDK8-STAT3 feedback loop

期刊：?Journal of Translational Medicine 1479-5876 7.4

實(shí)驗(yàn)?zāi)康??miR-26b-5p與細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶8（CDK8）或磷酸二酯酶4B（PDE4B）之間的相關(guān)性

實(shí)驗(yàn)方法和結(jié)果

1）構(gòu)建質(zhì)粒

報(bào)告基因質(zhì)粒：它用來(lái)插入miRNA靶序列，將野生型（WT）或者突變(MUT) CDK8/PDE4B 3’UTR序列克隆到pmirGLO載體中

轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)質(zhì)粒：miR-26b-5p 或NC

2）共轉(zhuǎn)染。將上述質(zhì)粒使用Lipofectamine? 3000轉(zhuǎn)染到HEK-293 T細(xì)胞。

3）檢測(cè)。當(dāng)miR-26b-5p在HEK-293 T細(xì)胞中過(guò)表達(dá)時(shí)，3′UTR-WT的熒光素酶活性測(cè)定顯著降低，而對(duì)3′UTR-MUT的熒光素酶活性沒(méi)有觀察到顯著影響

參考文獻(xiàn)：

Xu T, Xie M, Jing X, Jiang H, Wu X, Wang X, Shu Y. Loss of miR-26b-5p promotes gastric cancer progression via miR-26b-5p-PDE4B/CDK8-STAT3 feedback loop. J Transl Med. 2023 Feb 3;21(1):77. doi: 10.1186/s12967-023-03933-x. PMID: 36737782; PMCID: PMC9898947.