1.總糖和還原糖

（1）堿性銅試劑法測定還原糖是直接滴定還是間接滴定？兩種滴定方法各有何優(yōu)點？

我們采用的是堿性銅試劑法中的間接法測定還原糖的含量。間接法的優(yōu)點是操作簡便、

反應(yīng)條件溫和，缺點是在生成單質(zhì)碘和轉(zhuǎn)移反應(yīng)產(chǎn)物的過程中容易引入誤差；

直接法的優(yōu)點是反應(yīng)原理直觀易懂，缺點是操作較復(fù)雜，條件劇烈，不易控制。

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（2）分析X1與X2存在差異的原因？若差異較大說明什么？

（可能的答案）

操作失誤，偶然誤差。偶然誤差，實驗的精確度低，重現(xiàn)性差。

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2.粗脂肪

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（1）本實驗制備得到的是粗脂肪，若要制備單一組分的脂類成分，可用什么方法進(jìn)一步處理？

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硅膠柱層析，高效液相色譜，氣相色譜等。

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（2）本實驗樣品制備時烘干為什么要避免過熱??

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防止脂質(zhì)被氧化。

3.茶多糖

（1）試比較多種提取多糖的方法各有何優(yōu)缺點

1.溶劑提取法

溶劑提取為常用的傳統(tǒng)方法之一，有自身的優(yōu)點。如不需特殊設(shè)備，成本低等，但此法往往提取效率低且費時

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2. 酸提法

有些多糖適合用稀酸提取，并且能得到更高的提取率。但酸提法有其特殊性，只在一些特定的植物多糖提取中占有優(yōu)勢，目前報道的并不多。而且即使有優(yōu)勢，在操作上還應(yīng)嚴(yán)格控制酸度，因為酸性條件下可能引起多糖中糖苷鍵的斷裂。

3.堿提法

同樣，堿提優(yōu)勢也是因多糖類的不同而異。與酸提類似，堿提中堿的濃度也應(yīng)得到有效控制，因為有些多糖在堿性較強(qiáng)時會水解。另外，稀酸、稀堿提取液應(yīng)迅速中和或迅速透析，濃縮與醇析而獲得多糖沉淀。

4.酶提法

使用酶可降低提取條件，在比較溫和的條件中分解植物組織，加速多糖的釋放或提取。此外，使用酶還可分解提取液中淀粉、果膠、蛋白質(zhì)等非目的產(chǎn)物

5.超濾法

將超濾膜用于多糖這種生物活性物質(zhì)的分離，具有不損害活性、分離效率高、能耗低、設(shè)備簡單、可連續(xù)生產(chǎn)、無污染等優(yōu)點。

6.超聲提取

與常規(guī)提取法相比，超聲波提取可縮短提取時間，提高提取率

7.微波提取

值得注意的是微波和超聲波輔助提取可以提高有效成分的提取得率，縮短提取時間，但有時會造成提取物的組分更加復(fù)雜，分離困難

8.CO2超臨界萃取

超臨界CO2具有較好的溶劑特性，對于揮發(fā)性較強(qiáng)的成分、熱敏性物質(zhì)和脂溶性成分的提取分離效果明顯，具有保持有效成分的活性和無殘留溶劑等優(yōu)點。其缺點是設(shè)備復(fù)雜、運行成本高、提取范圍有限，使得超臨界萃取應(yīng)用受到限制。

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（2）多糖的分離方法有哪些？各是什么原理

2．1?除蛋白

選擇能使蛋白質(zhì)沉淀而不使多糖沉淀的試劑來處理

2 . 2脫色

植物多糖提取物中含有酚類化合物而使其顏色較深，可用吸附劑(纖維素、硅藻

土、活性炭等)、離子交換柱(DEAE一纖維素)、氧化劑(H2O2)等脫除.

2 . 3除小分子雜質(zhì)

纖維濾器透析法利用不同孔徑的膜使大小不同的分子分級

2 . 4 分級純化略。

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（3）為什么紅外光譜的測定要用溴化鉀？能不用溴化鉀，直接把化合物壓片后測定紅外光譜嗎？

KBr在中紅外區(qū)沒有吸收，作稀釋劑。不用會導(dǎo)致樣品的吸收會過高探測不到信號，此外用KBr壓片作為空白對照來掃描出基線。

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（4）試比較化合物的紫外-可見圖譜和紅外圖譜的區(qū)別。

原理不同

測定方法不同

紫外可見體系是比色杯與溶液，紅外是KBr壓片

譜圖的表示方法不同

提供的信息不同

4.氨基酸紙層析

（1）請對試驗中所用的幾種氨基酸移動快慢的原因給予簡要分析

展開劑：正丁醇－乙酸－水

脯氨酸(Pro)、纈氨酸(Val)、絲氨酸 (Ser)、亮氨酸(Leu)、精氨酸(Arg)

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-CH2-基增加，分子極性降低。-OH是極性基團(tuán)，陽離子極性更強(qiáng)。氨基酸極性越低，越容易溶于有機(jī)溶劑，Rf值越大，遷移越快。

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（2）若增加固定相的pH，本實驗中的幾種已知氨基酸的Rf值將如何變化？

pH影響極性基團(tuán)的解離形式，pH增加，Arg帶正電荷減少，極性降低，Rf增大。

pH影響有機(jī)溶劑（流動相）的含水量，pH增大，含水量增加。氨基酸是極性物質(zhì)，在流動相中的溶解度增大，Rf增大。

5.影響酶活性的因素

(1)本實驗中如何通過淀粉液加碘后的顏色的變化來判斷酶促反應(yīng)快慢的?

答:在唾液淀粉酶的作用下，淀粉水解，經(jīng)過一系列被稱為糊精的中間產(chǎn)物，最后生

成麥芽糖和葡萄糖。變化過程如下:淀粉- +紫色糊精-→紅色糊精- +麥牙糖、葡萄糖

淀粉、紫色糊精、紅色糊精遇碘后分別呈藍(lán)色、紫色與紅色。麥芽糖和葡萄糖遇碘不.

變色。因此反應(yīng)后顏色如為藍(lán)色說明酶活力低，淡黃色則說明酶活力高。

(2)如何通過加入班氏試劑后生成沉淀多少來反映酶促反應(yīng)快慢的?

答:淀粉與糊精無還原性，或還原性很弱，對本尼迪克特試劑呈陰性反應(yīng)。麥芽糖、葡萄糖

是還原糖，與本尼迪克特試劑共熱后生成紅棕色氧化亞銅的沉淀。因此，產(chǎn)生紅棕色氧化亞

銅的沉淀越多說明酶活力越高。

(3)通過本實驗，結(jié)合理論課的學(xué)習(xí)，小結(jié)出哪些因素影響唾液淀粉酶活性?是如何影響的?

答:溫度、pH、激活劑、抑制劑等。高于或低于最適溫度或pH,酶活力都會降低;激活劑

和抑制劑不是絕對的，只是相對而言，隨著濃度的變化而變化。

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6.堿性磷酸酶的分離提取及比活力的測定

(1)試說明用硫酸銨分級分離酶的方法及應(yīng)注意的事項。

答:用鹽分級沉淀是- -種應(yīng)用非常廣泛的方法。由于硫酸銨在水中溶解度很大( 20"C,每升

可溶760克)，并且對許多酶沒有很大的影響，因此它是最常用的鹽。例如:某酶(或蛋白

質(zhì))發(fā)生鹽析的范圍為35-65%飽和硫酸銨的濃度，因此可先選擇30%飽和硫酸銨濃度，去

沉淀雜蛋白，然后選擇70%飽和硫濃度酸銨，留沉淀(含所要的酶)。

注意事項:在用硫酸銨沉淀酶蛋白時，要注意緩沖液的pH值和溫度，鹽的溶解度隨溫度不

同而有較大的變化，同時酶的溶解度亦隨溫度的改變而改變。在加硫酸銨時，需事先將硫酸

銨粉末研細(xì)。加入過程需緩慢并及時攪拌溶解。攪拌要緩慢，盡量防止泡沫的形成，以免酶。

蛋白在溶液中表面變性。

(2)用正丁醇處理勻漿液可以有效地使堿性磷酸酶酶蛋白釋放，使酶的產(chǎn)量大大提高，這是為什么?

答:因為堿性磷酸酶酶是一種膜蛋白，正丁醇處理后可使結(jié)合在膜上的蛋白質(zhì)更多地釋放出

來。

(3)酶活力測定時，為什么必需先將酶液對緩沖液透析后才測定?

答:去除鹽離子的影響。

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7.堿性磷酸酶米氏常數(shù)的測定

（1）為什么空白對照一定要先加NaOH，后加酶？

NaOH抑制酶活性，使空白對照體系有酶但不發(fā)生酶促反應(yīng)

（2）在測定酶催化反應(yīng)的米氏常數(shù)Km和最大反應(yīng)速度Vm時，應(yīng)如何選擇底物濃度范圍?

答:底物濃度選擇范圍[S]=0.2-5.0 Km為宜。底物濃度選取還應(yīng)該注意其倒數(shù)能均勻分布。

（3）試說明米氏常數(shù)Km的物理意義和生物學(xué)意義。

答: (1) Km是酶的- -個極重要的動力學(xué)特征常數(shù)，Km 物理含義: ES 絡(luò)合物消失速度常

數(shù)與形成速度常數(shù)之比;其數(shù)值相當(dāng)于酶活性部位的一- 半被底物占據(jù)時所需的底物濃度。

(2)可根據(jù)Km估計底物濃度的水平。

(3) Km可作為同工酶的判斷依據(jù)。

(4)鑒別最適底物。

(5)有助于在酶學(xué)研究中對底物濃度的選擇。選用[S]>10Km 濃度進(jìn)行活力測定

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（4）為什么說米氏常數(shù)Km是酶的一個特征常數(shù)而Vm則不是?

答:某種酶的Km在給定的體系中不隨酶濃度改變而改變，也與酶的純度無關(guān)，因此是酶的

一個特征常數(shù)。但Vm隨酶濃度改變而改變。

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（5）酶活力測定時，為什么必需先將酶液對緩沖液透析后才測定?

答:去除鹽離子的影響。

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8.離子交換柱層析

（1）本實驗用到的幾種儀器的用途是什么？

闡明DEAE-纖維素柱層析純化酶蛋白的原理和方法

詳見課本

（2）能否將70%飽和度硫酸銨沉淀溶解酶液不經(jīng)過透析，直接上離子交換層析柱來純化酶？為什么？

不能。透析液中高濃度的鹽離子與蛋白競爭結(jié)合DEAE，使得蛋白不能很好地吸附在柱上，達(dá)不到分離純化的目的。

（3）實驗時應(yīng)該如何選擇緩沖液

設(shè)置多組不同pH的試管，找到能使目的蛋白與DEAE親和力最好的pH對應(yīng)的緩沖溶液。此外緩沖液中的離子不與交換柱和蛋白反應(yīng)。

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9.SDS-PAGE電泳

(1)簡述SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳測定分子量的原理;

答: 1) SDS能使蛋白質(zhì)的氫鍵、疏水鍵打開，并結(jié)合到蛋白質(zhì)分子上，形成蛋白質(zhì)- SDS

復(fù)合物。.

2) SDS 帶有大量負(fù)電荷，當(dāng)它與蛋白質(zhì)結(jié)合時，消除或掩蓋了不同種類蛋白質(zhì)間原

有電荷的差異，使SDS與蛋白質(zhì)的復(fù)合物都帶上相同密度的負(fù)電荷。

3) SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物在水溶液中的形狀一樣，都是近似于雪茄煙形的長橢圓棒。

4)不同的SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物都帶有相同密度的負(fù)電荷，并具有相同形狀;因此在一

定濃度的凝膠中，由于分子篩效應(yīng)，則電泳遷移率就成為蛋白質(zhì)分子量的函數(shù)。

(2)是否所有的蛋白質(zhì)用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳方法測定得到的分子量都完全可靠?

答:不是。

如電荷異?；驑?gòu)象異常的蛋白質(zhì)，帶有較大輔基的蛋白質(zhì)(如某些糖蛋白)以及一些

結(jié)構(gòu)蛋白如膠原蛋白等。

例如組蛋白F1，它本身帶有大量正電荷，因此，盡管結(jié)合了正常比例的SDS，仍不能

完全掩蓋其原有正電荷的影響，它的分子量是21,000， 但SDS-凝膠電泳測定的結(jié)果卻是

35,000

（3）為什么要在樣品中加少許溴酚蘭和一定濃度的甘油溶液？甘油及溴酚蘭的作用分別是什么？

溴酚藍(lán)用于指示電泳終點,因為它跑在蛋白前面,一般當(dāng)溴酚藍(lán)跑到末端時停止電泳.

甘油比重大,使樣品下沉,在點樣孔底部鋪成一線,避免樣品漂逸,且?guī)弯J利好看.

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