圖1.一些最常用的 DNA (A-C) 和 RNA 探針合成方法 (D) 的表示。

?雜交可以發(fā)生在互補(bǔ)的脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸之間，因此基于 DNA 或 RNA 的探針可用于定位給定樣品中的 DNA 或 RNA。 然而，這些不同類型的探針并不等同，必須選擇最適合實(shí)驗(yàn)的選項(xiàng)。 例如，值得考慮的是，RNA-RNA 雜交體比 RNA-DNA 雜交體更穩(wěn)定，而 RNA-DNA 雜交體又比 DNA-DNA 雜交體更穩(wěn)定。 根據(jù) ISH 目標(biāo)，這種穩(wěn)定性差異會影響探針性質(zhì)的選擇。

DNA 探針是 DNA 片段，其中包含對目標(biāo)染色體區(qū)域具有特異性的核苷酸序列。 最常用的合成方法之一是尼克平移反應(yīng)，分兩步進(jìn)行（圖 1A）。 首先，用低濃度的 DNAse I 酶處理模板 DNA（通常是細(xì)菌人工染色體 [BAC]），隨機(jī)切割 DNA，產(chǎn)生游離的 3'-OH 基團(tuán)。 后者將在第二步中充當(dāng)引物，此時(shí) DNA 聚合酶 I 將通過 5'-3' 核酸外切酶活性去除核苷酸，同時(shí)延長 3'-OH 基團(tuán)。 反應(yīng)混合物中可用的修飾核苷酸隨后將摻入新合成的鏈中，從而允許標(biāo)記探針。 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) (PCR) 是另一種常見的 DNA 探針合成方法：目標(biāo)序列的擴(kuò)增可以在適當(dāng)標(biāo)記的引物（末端標(biāo)記 PCR，圖 1B）或反應(yīng)混合物存在的情況下實(shí)現(xiàn) 可以包含標(biāo)記的 dNTP，因此反應(yīng)產(chǎn)物在合成時(shí)被標(biāo)記（連續(xù)標(biāo)記 PCR，圖 1C）。 基于 DNA 的 ISH 更常用于檢測細(xì)胞核中的特定 DNA 序列，例如識別潛在的基因擴(kuò)增、缺失、易位和染色體數(shù)目。

RNA 探針是一段單鏈 RNA，用于通過雜交檢測互補(bǔ)核酸序列的存在。 RNA 探針可以通過體外轉(zhuǎn)錄高效且一致地產(chǎn)生。 這樣做的常見策略是克隆要在兩個(gè)相反方向的啟動子之間轉(zhuǎn)錄的 DNA，以便使用適當(dāng)?shù)木酆厦负铣捎辛x或反義 RNA。 在這種情況下，通過摻入修飾的核苷酸，RNA 探針在轉(zhuǎn)錄時(shí)被連續(xù)標(biāo)記，從而產(chǎn)生具有高度標(biāo)記摻入的探針（圖 1D）。 此外，由于 RNA 探針是從線性化模板合成的，因此所有探針分子的長度都是一致的。 RNA 探針提供了幾個(gè)與其使用相關(guān)的關(guān)鍵優(yōu)勢，包括相對于 DNA 探針的改進(jìn)信號。 然而，由于 RNA 的內(nèi)在不穩(wěn)定性和對 RNase 降解的敏感性，必須像對待任何其他 RNA 制劑一樣小心對待 RNA 探針。 RNA ISH 主要用于研究基因轉(zhuǎn)錄，從而研究細(xì)胞水平的基因表達(dá)。