ELISA操作步驟復(fù)雜，影響反應(yīng)因素較多，特別是固相載體的包被難達(dá)到各個體之間的一致，因此在定量測定中，每批測試均須用一系列不同濃度的參考標(biāo)準(zhǔn)品在相同的條件下制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

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測定大分子量物質(zhì)的夾心法ELISA，標(biāo)準(zhǔn)曲線的范圍一般較寬，曲線最高點的吸光度可接近2.0，繪制時常用半對數(shù)紙，以檢測物的濃度為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)，將各濃度的值逐點連接，所得曲線一般呈S形，其頭、尾部曲線趨于平坦，中央較呈直線的部分是最理想的檢測區(qū)域。

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測定小分子量物質(zhì)常用競爭法，其標(biāo)準(zhǔn)曲線中吸光度與受檢物質(zhì)的濃度呈負(fù)相關(guān)。

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標(biāo)準(zhǔn)曲線的形狀因試劑盒所用模式的差別而略有不同。下面簡要介紹使用Curve Expert軟件繪制ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線的步驟。

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1、標(biāo)準(zhǔn)曲線數(shù)據(jù)的采集與處理。在Excel中輸入標(biāo)準(zhǔn)曲線的數(shù)據(jù)濃度和吸光度OD值。并進(jìn)行相應(yīng)的處理，如減去空白孔OD值、平行組取平均值。

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2、打開Curve Expert軟件，在表格中填上（復(fù)制黏貼也可）Excel中處理好的數(shù)據(jù)。注意X列一般填吸光度OD值，Y列填標(biāo)準(zhǔn)品的濃度，不要弄反。如下圖。

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3、數(shù)據(jù)錄入后，點擊工具欄上的“Tools”并在下拉菜單中找到“CurveFinder”工具，左鍵單擊。（此步驟用于擬合函數(shù)未知的情況，如果擬合函數(shù)已知，步驟見后面）

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或者直接左鍵點擊工具欄下方的快捷圖標(biāo)按鈕。

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4、在彈出的對話框中勾選所需要的函數(shù)模型。（可以根據(jù)前面的散點圖粗略判讀，亦可以全部都勾上）此處注意，對話框下方有個選擇多項式函數(shù)的項次的選項，從3開始，2有一個單獨名稱列出。

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5、點擊“OK”按鈕后，軟件會自動擬合計算，并將擬合函數(shù)按照r值的大小依次排列出來。并打開一個r值最大的擬合曲線對話框。此處需要注意的是，多項式項次越高，r值越大，但是曲線會呈波浪形，此時應(yīng)該將采集的真實數(shù)據(jù)代入公式，比較計算值（濃度）與實際濃度的差別大小進(jìn)行取舍。（曲線擬合不同于點對點和插值法，不需要曲線一定經(jīng)過散點）

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如果需要查看其它擬合函數(shù)的曲線信息，可以在函數(shù)列表中左鍵雙擊對應(yīng)的名稱即可。

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6、在擬合曲線對話框中右鍵單擊，得到一個快捷菜單，從菜單中選擇并點擊Analyze工具，得到一個曲線分析對話框。在分析對話框中，點擊“Find y=f（x）”界面，在該界面的“At X=”處輸入待測樣本的OD值，點擊下方的“Calculate”，即可在“Y=”處得到對應(yīng)的濃度值。

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此外，也可以點擊擬合曲線對話框左上角“Info”按鈕，得到擬合曲線對應(yīng)的擬合函數(shù)公式，并復(fù)制公式，在Excel中自行計算待測樣本的濃度。

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7、批量計算出待測樣本的濃度后，可以在擬合曲線對話框中，右鍵單擊，在得到的快捷菜單中選擇“Generate Table”，在彈出的對話框中，選擇要存儲的位置。存儲文件可以通過Curve Expert或Excel打開。

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8、如前第3步所述，如果擬合函數(shù)已知，可從工具欄“Apply Fit”下拉菜單中選擇所需要的擬合函數(shù)，得到相應(yīng)的曲線信息，并進(jìn)行待測樣本的計算。

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或者直接左鍵點擊工具欄下方的已列出的擬合函數(shù)快捷圖標(biāo)按鈕。

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