【研究背景】

在針對(duì)COVID-19的眾多治療方法中，針對(duì)SARS-CoV-2的中和抗體和瑞德西韋（remdesivir）被認(rèn)為是治療COVID-19極具前景的兩種藥物。然而，雖然兩種方法在COVID-19患者的治療中已經(jīng)取得了一定療效，但是仍存在一些問(wèn)題有待解決。在中和抗體治療COVID-19方面，目前備受關(guān)注的兩個(gè)問(wèn)題是病毒對(duì)抗體產(chǎn)生的耐藥性和潛在的抗體依賴性增強(qiáng)（antibody dependent enhancement，ADE）效應(yīng)；而以remdesivir為代表的小分子藥物由于存在一定的毒副作用，患者的收益仍有限。

【成果介紹】

為此，中山大學(xué)附屬第五醫(yī)院黃曦教授團(tuán)隊(duì)通過(guò)將兩種靶向新冠病毒S蛋白的中和抗體的單鏈可變片段（single-chain variablefragment, ?scFv）以雙特異性嵌合抗原受體（Chimeric antigen receptor，CAR）蛋白的方式表達(dá)在納米囊泡表面，構(gòu)建一種同時(shí)具有中和病毒和靶向遞送藥物能力的納米囊泡平臺(tái)技術(shù)，從而解決中和抗體和remdesivir治療COVID-19時(shí)遇到的難題。

首先，該團(tuán)隊(duì)成功制備了CR3022 CAR-T、B38 CAR-T和CR3022/B38 CAR-T細(xì)胞，并使用這三種CAR-T細(xì)胞成功制備了相應(yīng)的納米囊泡，這些納米囊泡粒徑均一、形態(tài)良好且均有CAR蛋白的表達(dá)。（圖1-2）

接著，該團(tuán)隊(duì)驗(yàn)證了三種CAR-T細(xì)胞來(lái)源的納米囊泡對(duì)新冠S蛋白具有良好的靶向性，這為藥物靶向遞送奠定了基礎(chǔ)。（圖3）

緊接著，利用中和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了三種CAR-T細(xì)胞來(lái)源的納米囊泡對(duì)S蛋白假病毒均具有良好的中和能力。其中，CR3022/B38 NVs比CR3022 NVs和B38 NVs具有更強(qiáng)的中和能力，說(shuō)明兩種scFv的共表達(dá)具有功能疊加效應(yīng)。此外，盡管S蛋白中的N439K突變大幅降低了B38 NVs的中和能力，但僅輕度降低了CR3022/B38 NVs的中和能力，說(shuō)明兩種scFv的共表達(dá)可減少因S蛋白突變而造成的病毒逃逸。（圖4）

然后，通過(guò)電穿孔技術(shù)，納米囊泡對(duì)remdesivir的裝載效率達(dá)到了20%左右。而且，CR3022/B38 NVs能有效地將remdesivir靶向遞送到293T-S細(xì)胞上。（圖5）

最后，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，從尾靜脈注射的CR3022/B38 NVs能有效聚集在LLC-S腫瘤組織中。此外，CR3022/B38 NVs能有效地阻斷S蛋白假病毒感染LLC-ACE2腫瘤組織。這些結(jié)果表明，CR3022/B38 NVs在體內(nèi)也具有良好的靶向性和中和能力。（圖6）

原理圖.?靶向S蛋白CAR-T細(xì)胞來(lái)源的納米囊泡的制備方法和治療原理

圖?1.?三種CAR-T?細(xì)胞的制備和表征。a)CR3022 CAR、B38 CAR和CR3022/B38 CAR的分子設(shè)計(jì)。b)?通過(guò)熒光顯微鏡觀察慢病毒轉(zhuǎn)染T?細(xì)胞的效率。c)?使用蛋白質(zhì)?L?檢測(cè)?T?細(xì)胞上CAR蛋白的表達(dá)。

圖?2.三種?CAR-T?細(xì)胞來(lái)源的納米囊泡的制備和表征。

a) TEM?檢測(cè)三種納米囊泡的形態(tài)和粒徑。比例尺：100 nm。b)?通過(guò)?NTA?測(cè)定三種納米囊泡的尺寸分布。c）通過(guò)蛋白質(zhì)印跡分析的三種CAR-T細(xì)胞的納米囊泡和全細(xì)胞裂解物中CAR蛋白的表達(dá)。?d)?流式細(xì)胞術(shù)分析納米囊泡上?scFv?的表達(dá)。

圖?3.?三種納米囊泡在體外與S蛋白的特異性結(jié)合能力。?a）通過(guò)共聚焦驗(yàn)證納米囊泡的靶向性；?b）通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)驗(yàn)證納米囊泡的靶向性

圖?4.?三種納米囊泡有效中和了S蛋白假病毒。a)?在不同?MOI?下使用S蛋白假病毒感染293T?和293T-ACE2細(xì)胞。?b-e)?不同納米囊泡（外泌體）中和S蛋白時(shí)的IC50。

圖?5. CR3022/B38 NVs?向293T-S?細(xì)胞遞送瑞德西韋的效率。a)?使用分光光度計(jì)確定瑞德西韋的標(biāo)準(zhǔn)曲線。b)?使用不同方法將瑞德西韋載入納米囊泡的裝載效率。?c)?載有瑞德西韋的納米囊泡在不同溫度下的藥物釋放曲線。?d)?殘留在復(fù)融后納米囊泡中的瑞德西韋。

?e) PBS、Free NVs、remdesivir、remdesivir-free NVs?和?remdesivir-CR3022/B38 NVs?分別與?293T?或?293T-S?細(xì)胞共同孵育，然后進(jìn)行鈣黃綠素-AM/PI?染色和熒光顯微鏡檢測(cè)。

圖?6. CR3022/B38 NVs?在體內(nèi)的靶向性和中和能力。

a, b)? DiR?標(biāo)記的Free NVs?和CR3022/B38 NVs在小鼠器官和腫瘤中的積累

c)?體內(nèi)S蛋白假病毒中和試驗(yàn)的流程圖。?d)注射S蛋白假病毒后，對(duì)小鼠進(jìn)行?IVIS?成像。

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總而言之，該團(tuán)隊(duì)證明CR3022/B38 NVs對(duì)S蛋白假病毒具有良好的中和能力，能夠有效地減少因病毒突變發(fā)生的耐藥；同時(shí)由于該囊泡不含有Fc段，有望規(guī)避ADE效應(yīng)。此外，由于CR3022/B38 NVs具有良好的藥物裝載能力和靶向性，可以有效地將抗病毒藥物遞送到病毒感染的主要部位，從而減少藥物的毒副作用，提高藥物的療效。裝載remdesivir的CR3022/B38 NVs同時(shí)具備中和病毒和抑制病毒復(fù)制的能力，因此能更好地清除機(jī)體內(nèi)的病毒。

中山大學(xué)博士生朱天川、肖雨晨、孟曉軍為論文共同第一作者，黃曦教授（中山大學(xué)附屬第五醫(yī)院）、單鴻教授（中大五院）和劉磊教授（深圳第三人民醫(yī)院）為該文章的共同通訊作者。

【作者簡(jiǎn)介】

黃曦，博士生導(dǎo)師、教授，主要研究領(lǐng)域：CAR-T細(xì)胞，IPS細(xì)胞和外泌體在腫瘤疾病中的應(yīng)用。

【文章信息】

Zhu, T., Xiao, Y., Meng, X.?et al.?Nanovesiclesderived from bispecific CAR-T cells targeting the spike protein of SARS-CoV-2for treating COVID-19.?J Nanobiotechnol?19,?391(2021). https://doi.org/10.1186/s12951-021-01148-0

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