阿片藥物危機催生了非成癮性疼痛治療需求。近日，來自牛津大學David Bennett團隊，由Jimena Perez-Sanchez 和Steven J. Middleton 等人研究評估了直接抑制感覺神經(jīng)元中與疼痛相關(guān)的過度活躍是否可能是種有針對性的疼痛治療策略。結(jié)果顯示，PSAM4-GlyR激活抑制感覺神經(jīng)元，改善小鼠嚴重疼痛、炎癥和神經(jīng)性疼痛行為。雖需人體驗證，但暗示了PSAM4-GlyR在基因治療疼痛中的潛力。

他們的成果發(fā)表在最新一期的Science Translational Medicine雜志上，名為 “A humanized chemogenetic system inhibits murine pain-related behavior and hyperactivity in human sensory neurons”

慢性疼痛是醫(yī)學難題，影響大量患者。感覺神經(jīng)元活性增加是炎癥和神經(jīng)性疼痛的主要原因。當前已有一些研究追求化學遺傳學方法，通過調(diào)節(jié)特定受體來控制神經(jīng)元活動，可能提供潛在治療選擇。最新的pharmacologically selective actuator modules具有廣泛前景，它是基于改進的人類ɑ7煙堿乙酰膽堿（ACh）受體配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域，不再結(jié)合ACh，而是超強藥理選擇效應(yīng)分子（uPSEMs）。PSAM最新版本獲得FDA批準，使用varenicline藥物，與人類甘氨酸受體孔域結(jié)合，形成PSAM4-GlyR，激活氯化物通道。

1. 生成新的PSAM4-GlyR結(jié)構(gòu)

作者對PSAM4-GlyR結(jié)構(gòu)進行改進，并確保其適合包裝成AAV載體，以進行體內(nèi)輸送。最有潛力的結(jié)構(gòu)為pCAG-mCherry-tPT2A-PSAM4-GlyR（mCherry-T-PSAM4-GlyR）。在HEK（人類胚胎腎臟） 293T細胞中評估其表達和功能，通過全細胞膜片鉗記錄測量添加varenicline后的膜電導率。結(jié)果表明mCherry-T-PSAM4-GlyR功能正常，且varenicline應(yīng)用后膜電導率顯著增加，與原始結(jié)構(gòu)相似。因此，作者選擇mCherry-T-PSAM4-GlyR（及僅使用mCherry作為控制組）進行后續(xù)實驗（圖1A）。

2. PSAM4-GlyR的激活使小鼠感覺神經(jīng)元的電活動沉默，并抑制dorsal horn neurons的傳播

為了評估PSAM4-GlyR在感覺神經(jīng)元中作為化學遺傳“消音器”的適用性，作者轉(zhuǎn)染了DRG感覺神經(jīng)元，使用mCherry-alone或mCherry-T-PSAM4-GlyR結(jié)構(gòu)（圖1b）。在實驗中，他們選擇了20 nM varenicline作為最佳激活濃度。這些激動劑導致了膜電導率的增加和膜電位去極化（圖1c-e）。在PSAM4-GlyR神經(jīng)元中，激動劑給藥增加了在其表達神經(jīng)元中產(chǎn)生動作電位所需的電流，但在控制神經(jīng)元中沒有產(chǎn)生AP（圖1G）。激動劑有效地沉默了感覺神經(jīng)元，降低了輸入電阻，并增加了基強度（圖1l）。所有這些效應(yīng)在15分鐘的激動劑沖洗后都可逆轉(zhuǎn)。這些結(jié)果表明，PSAM4-GlyR通過大規(guī)模氯離子通路，有力、有效且可逆地抑制感覺神經(jīng)元活動。

為驗證神經(jīng)元活動在脊髓突觸前末端的有效沉默，作者測量了突觸傳輸。他們記錄dorsal horn neurons的電活動，并測量ePSCs引起的單突觸興奮性突觸后電流 （圖1，M和N）。結(jié)果顯示，感覺神經(jīng)元的電活動沉默影響了信息傳遞到脊髓（圖1，O和P）。

圖1. PSAM4-GlyR可以可逆地使小鼠感覺神經(jīng)元安靜下來，并減少突觸傳遞

3. PSAM4-GlyR的激活導致熱和機械靈敏度降低

作者驗證了體內(nèi)外PSAM4-GlyR激活對神經(jīng)元的抑制作用。通過鞘內(nèi)注射PSAM4-GlyR病毒載體，有選擇地作用于DRG感覺神經(jīng)元，而不影響脊髓神經(jīng)元。經(jīng)過6至8周處理后，檢測熱敏感性。隨后，腹腔內(nèi)注射uPSEM792（1毫克/千克）產(chǎn)生短期熱敏感性降低，而更高劑量的uPSEM792（5毫克/千克）可導致持久效果。長期測試表明PSAM4-GlyR表達和功能穩(wěn)定，并通過varenicline可逆地影響感官行為 （圖。2，G到K）。

圖2.通過激動劑誘導的PSAM4-GlyR激活，對敏銳的感官行為進行穩(wěn)健、可逆和可重復的沉默

4. PSAM4-GlyR在DRG感覺神經(jīng)元中的穩(wěn)定表達

經(jīng)行行為實驗驗證PSAM4-GlyR的鞘內(nèi)病毒輸送后長期表達。不偏向任何類型的感覺神經(jīng)元，50%的L4 DRG神經(jīng)元未表現(xiàn)mCherry熒光信號（圖3B）。AAV9-mCherry-T-PSAM4-GlyR選擇性地轉(zhuǎn)導DRG神經(jīng)元亞群，不同亞群表達相近，但酪氨酸羥化酶亞群表達較低。PSAM4-GlyR廣泛分布于脊髓表層和深層，未觀察到脊髓神經(jīng)元表達mCherry-T-PSAM4-GlyR（圖3I）。ATF3未增加，表明長期PSAM4-GlyR表達與神經(jīng)元損傷無關(guān)。結(jié)果表明，PSAM4-GlyR鞘內(nèi)輸送有效地選擇性地轉(zhuǎn)導DRG神經(jīng)元，并在數(shù)月內(nèi)保持穩(wěn)定。

圖3. AAV9-mCherry-T-PSAM4-GlyR在感覺神經(jīng)元中選擇性表達的長期穩(wěn)定

5. PSAM4-GlyR介導的在兩種炎癥性疼痛模型中抑制疼痛相關(guān)行為

炎癥或傷害后，痛覺受體變得敏感，引發(fā)疼痛。作者研究了沉默系統(tǒng)在病理性疼痛中的應(yīng)用。首先，采用炎癥性疼痛模型，注射福爾馬林至小鼠爪，其中一組表達PSAM4-GlyR。結(jié)果顯示，PSAM4-GlyR小鼠表現(xiàn)出較少疼痛行為。進一步在炎癥性關(guān)節(jié)疼痛模型中驗證，PSAM4-GlyR沉默可減輕機械超敏，可通過藥物美洛昔康或Varenicline實現(xiàn)。數(shù)據(jù)暗示，PSAM4-GlyR沉默可減輕炎癥引起的疼痛行為（圖4B-H）。

圖4. PSAM4-GlyR介導的炎癥性關(guān)節(jié)和神經(jīng)性疼痛的沉默

6. PSAM4-GlyR的激活抑制了人類衍生感覺神經(jīng)元的興奮性

作者驗證了PSAM4-GlyR在動物模型中的有效性，現(xiàn)在將其擴展到人類hiPSC-SNs。通過病毒表達，成功將PSAM4-GlyR引入hiPSC-SNs中，觀察到其在神經(jīng)元興奮性上的調(diào)控效果（圖5A-J)。PSAM4-GlyR激活也可以在人類感覺神經(jīng)元模型中抑制神經(jīng)元活動，驗證其作為潛在基因治療工具的重要性。

圖5. PSAM4-GlyR介導的人類iPSC衍生感覺神經(jīng)元的沉默

總結(jié)

通過表達人類PSAM4-GlyR基因，可有效抑制小鼠感覺神經(jīng)元活動，減少炎癥和神經(jīng)源性疼痛。此外，PSAM4-GlyR還能有效抑制人類感覺神經(jīng)元興奮性，減少IEM導致的異常放電。這一研究為應(yīng)對慢性疼痛疾病提供了有望的基因治療方法。

原文鏈接：

https://www.science.org/doi/10.1126/scitranslmed.adh3839

參考文獻

Perez-Sanchez J, Middleton SJ, Pattison LA, Hilton H, Ali Awadelkareem M, Zuberi SR, Renke MB, Hu H, Yang X, Clark AJ, St John Smith E, Bennett DL. A humanized chemogenetic system inhibits murine pain-related behavior and hyperactivity in human sensory neurons. Sci Transl Med. 2023 Oct 4;15(716):eadh3839. doi: 10.1126/scitranslmed.adh3839. Epub 2023 Oct 4. PMID: 37792955; PMCID: PMC7615191.

編譯作者：Ayden（brainnews創(chuàng)作團隊）

校審：Simon（brainnews編輯部）






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