金龜子綠僵菌是一種商業(yè)化并廣泛用于防治各類害蟲的生防真菌，但在生產實踐中殺蟲作用緩慢、防治效果不穩(wěn)定、易受環(huán)境中的高溫和強紫外線等因素的影響，在一定程度限制了其大規(guī)模的應用。目前通過誘變改良菌株的方式可提高綠僵菌快速殺蟲的能力，但其中的誘變機制卻不盡完善。

2022年10月，華南農業(yè)大學黃振研究團隊在Microbiology Spectrum（Q1, IF=9.04）上在線發(fā)表了題為“Proteomic analysis of a hypervirulent mutant of the insectpathogenic fungus Metarhizium anisopliae?reveals changes in pathogenicity and terpenoid pathways” ,同年在Environmental Microbiology發(fā)表了題為“Mutation of a prenyltransferase results in accumulation of subglutinols and destruxins and enhanced virulence in the insect pathogen, Metarhizium anisopliae”的研究論文，該研究利用TMT蛋白組學揭示了次級代謝產物生物合成途徑中的萜類代謝在紫外線誘變影響真菌毒素代謝產物、增強誘變菌株抗強紫外線和耐高溫性能、大幅縮短殺蟲時間方面起著關鍵作用，萜類代謝途徑中的FPPS1和GGPPS5基因可作為篩選抗強紫外線、耐高溫、大幅縮短殺蟲時間的有效基因靶點。該研究為解析紫外線誘變機制提供了新思路。中科新生命為該研究提供了TMT蛋白質組學技術服務。

?研究材料

金龜子綠僵菌（Metarhizium anisopliae）野生菌株及其紫外線誘變菌株

?技術路線

步驟1：誘變菌株的蛋白質組學分析及差異蛋白的代謝通路分析；

步驟2：萜類代謝途徑中差異表達蛋白及對應基因的突變序列分析；

步驟3：FPPS1和GGPPS5基因敲除對菌株抗紫外線和耐高溫、毒力、殺蟲時間的影響；

步驟4：敲除突變體中次級代謝產物毒素變化的檢測與分析。

?研究結果

1. 紫外線誘變菌株中的蛋白質組學分析及差異蛋白的代謝通路分析

前期研究表明誘變菌株具有抗紫外線、耐37℃高溫的優(yōu)異性能，對小菜蛾的殺蟲時間縮短、毒力也明顯提升，同時誘變菌株的次級代謝產物發(fā)生明顯變化。為了查明紫外線誘變對菌株抗逆性和毒力的影響機制，作者對菌株誘變前后進行了TMT蛋白質組學分析，結果顯示：有842個蛋白表達發(fā)生明顯改變，其中上調差異表達蛋白360個、下調差異表達蛋白482個。 KEGG通路、GO功能和PPI蛋白互作分析發(fā)現，這些差異表達蛋白質主要涉及biosynthesis of secondary metabolites, biosynthesis of amino acids, ribosome, carbon metabolism，steroid biosynthesis和terpenoid backbone biosynthesis等生物合成代謝途徑（圖1和圖2），主要參與了metabolic process, cellular process, localization，biological regulation 和regulation of biological process等重要生物學過程（圖2）。

圖1 誘變菌株差異表達蛋白質相互作用網絡

注：A. biosynthesis of amino acids, B. biosynthesis of secondary metabolites, C. terpenoid backbone biosynthesis, D. steroid biosynthesis.

圖2 誘變菌株差異表達蛋白質GO功能富集分析

2. 誘變菌株萜類生物合成代謝途徑中蛋白酶的表達發(fā)生明顯變化，對應的基因發(fā)生突變

經蛋白組學比較分析發(fā)現菌株誘變前后的萜類生物合成代謝途徑（terpenoid biosynthesis pathway）中蛋白酶類的表達發(fā)生了明顯的變化，其中甲羥戊酸途徑（MVA）中有11種蛋白酶的表達發(fā)生了明顯的上調或下調（表1），進一步基因測序比對分析發(fā)現有4個蛋白對應的基因發(fā)生了突變、5個蛋白對應的基因沒有突變，其中，紫外誘變株的FPPS1（A0A0B4FZV1）和GGPPS5（A0A0D9NRB6）合成酶基因的ORF序列分別發(fā)生了22 bp和1032/315 bp的突變，GGPPS5蛋白中有5個氨基酸發(fā)生了突變。這個發(fā)現為解析紫外線誘變機制提供了新的認識。

表1 誘變菌株的萜類代謝途徑中相關蛋白和基因突變分析

3. 敲除FPPS1和GGPPS5基因提高了菌株抗紫外線和耐高溫性能、大幅縮短了殺蟲時間

敲除目標基因FPPS1 / GGPPS5后，突變體抗紫外線和耐高溫性能明顯增強，在強紫外線下照射40分鐘、37℃高溫下敲除突變體的孢子萌發(fā)時間顯著縮短（圖 3）。敲除突變體的孢子萌發(fā)時間提前1-3 h、GT50（50%真菌孢子萌發(fā)所需時間）縮短了2 h以上。敲除FPPS1 / GGPPS5基因后綠僵菌突變體的殺蟲時間大幅縮短（敲除突變體對褐飛虱成蟲的LT50=3.27 / 3.09 d，野生菌的LT50=5.90 d），敲除突變體菌株比野生菌株的毒力提高了10~100倍（LC50減少倍數）（表2）。這個發(fā)現為篩選抗紫外線和耐高溫的誘變菌株提供了新的基因靶點。

注：GT50為50%真菌孢子萌發(fā)所需時間，IT50為50%孢子在高溫或紫外線下的萌發(fā)率與常規(guī)條件下孢子萌發(fā)率的比值，MaUV-HV為誘變菌株。

表2 誘變菌株和野生菌株的生物測定

4. 目標基因ΔFPPS1/ΔGGPPS5敲除突變體中的次級代謝產物毒素發(fā)生了改變

經GC/LC-MS檢測分析，目標基因ΔFPPS1/ΔGGPPS5的敲除突變體菌株次級代謝產物中的綠僵菌素A、B、C、D、A2等真菌毒素發(fā)生了明顯的變化，其中有些毒素的含量增加10-100倍，Analog 45則在誘變株的次級代謝產物中消失了（表3）。

表3 綠僵菌野生型（WT）和敲除突變體ΔFPPS1/ΔGGPPS5菌株中的代謝產物

華南農業(yè)大學殺蟲真菌研究團隊黃振老師為論文的通訊作者，美國佛羅里達大學的Nemat O. Keyhani教授為論文共同通訊作者；華南農業(yè)大學的碩士生黃文友、余丹和本科生黃沛銓為共同第一作者；華南農業(yè)大學的碩士生李成周、佛羅里達大學的黃帥帥博士、廣州市食品檢驗所的戚平研究員和黃松參與了本研究。

論文鏈接：
https://doi.org/10.1128/spectrum.00760-22

https://doi.org/10.1111/1462-2920.15859

?小編小結

作者提供了綠僵菌萜類生物合成代謝途徑中FPPS1/GGPPS5基因突變或敲除后，突變菌株的抗紫外線和耐高溫性能增強、次級代謝產物毒素發(fā)生改變、菌株毒力提高、殺蟲時間大幅縮短的證據。從機制上講，FPPS1/GGPPS5基因突變或敲除、改變了綠僵菌萜類生物合成代謝途徑中的類異戊二烯化合物等中間代謝產物的流向，影響了萜類生物合成及其相關的其它代謝產物生物合成代謝途徑的正常代謝，從而導致綠僵菌次級代謝產物毒素的改變，最終提高了菌株的毒力、大幅縮短了殺蟲時間。這個發(fā)現為解析紫外線誘變機制提供了新的認識，為篩選抗紫外線和耐高溫的高毒力誘變菌株提供了新的基因靶點。為調控殺蟲真菌的毒素代謝、提高菌株毒力和大幅縮短殺蟲時間提供技術支撐，為殺蟲真菌的改良與高毒力菌株的篩選提供參考。

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