Identification of a Novel N7-Methylguanosine-Related LncRNA Signature Predicts the Prognosis of Hepatocellular Carcinoma and Experiment Verification

結果

HCC 中差異表達的 m7G 相關基因

我們根據 TCGA-LIHC 中的表達數據（371 個 HCC 樣本和 50 個正常樣本）對 29 個 m7G 相關基因進行了差異表達分析。差異表達模式呈現(xiàn)為熱圖。具體而言，NUDT11 表達水平顯著更高，而 NUDT10 在腫瘤組織中的表達水平顯著降低。此外，相關性分析顯示 29 個 m7G 相關基因之間存在內在關聯(lián)

。

m7G 相關 LncRNA 預測特征的鑒定

首先，我們使用 Spearman 相關分析（|r系數| > 0.3 和p?< 0.001）通過 m7G 相關 mRNA 和 lncRNA 的共表達篩選了 539 個 m7G 相關 lncRNA 。然后，使用單變量 Cox 回歸將總共 84 個 lncRNA 鑒定為預后因素。對這些具有預后意義的 lncRNA 進行套索回歸分析以避免可能的過度擬合并提高預測準確性，然后進行多變量 Cox 回歸。最后，我們篩選了七個有意義的 m7G 相關 lncRNA 用于預測特征（表格1,補充圖 S1?)。包含 m7G 相關 lncRNAs-mRNAs 的共表達網絡在圖 3光盤。每個患者的 m7GRLsig 評分計算為流動方程：風險評分 = (0.18133 × ZFPM2-AS1) + (0.36071 × AC092171.2) + (0.34046 × PIK3CD-AS2) ? (0.42774 × HPN-AS1) -( 0.41772 × AC022613.1) + (0.48860 × NRAV) + (0.34254 × CASC19)。

m7GRLSig 的預后影響

HCC 患者隨后根據中位風險評分作為截止值分為低風險和高風險組，并隨機分配到兩個內部驗證組。Kaplan-Meier 分析顯示，在兩個內部集合中，高風險組的 OS 均短于低風險組（所有p?< 0.001）。整個集合產生了相似的結果 (?p?< 0.001)。第一個內部組的 1 年、3 年和 5 年生存曲線下面積 (AUC) 值分別為 0.841、0.739 和 0.763。第二個內部組的 1 年、3 年和 5 年生存率的 AUC 值分別為 0.695、0.680 和 0.748.?整個集合也顯示了該模型的良好預測能力。風險曲線和散點圖表明生存狀態(tài)取決于新開發(fā)的簽名。熱圖顯示了七種 lncRNA 在高危組和低危組之間的不同表達模式（圖 5e,f,補充圖 S2e?)。此外，我們發(fā)現(xiàn)高危組和低危組在 T 分期、分期、分級和 fustat 方面存在差異（p < 0.05）?我們評估了具有不同臨床病理特征的亞組中的 OS。我們發(fā)現(xiàn) m7GRLsig 在按男性患者（）和年齡、T 分期（T1 和 T2-4）、分期

?m7GRLSig 的獨立預后分析

單變量 Cox 回歸分析顯示風險評分與 HCC 患者的 OS 顯著相關。多元回歸分析進一步表明，風險評分可以作為 HCC 患者的獨立預后指標).?風險評分的AUC值優(yōu)于臨床特征對HCC預后的預測準確性，表明 M7RLSig 對 HCC 預后的風險模型被認為是可靠的。此外，我們建立了列線圖來預測 1、3 和 5 年的 HCC 預后。校準曲線顯示列線圖具有良好的預測能力

通過 m7GRLSig 分層的差異 m7G 修改狀態(tài)

基于全基因組、m7G 相關基因、m7G 相關 lncRNA 和 m7GRLSig 模型進行 PCA 分析，以進一步評估 m7GRLSig。全基因組表達、m7G相關基因, 和 m7G 相關的 lncRNAs?不能有效區(qū)分低危和高?；颊?；然而，m7GRLSig 模型的條款可以有效地區(qū)分這兩組, 揭示了低風險組和高風險組之間不同的 m7G 修飾狀態(tài)。m7GRLSig 的判別力進一步證明了該模型具有可靠的聚類能力。使用 GSEA 鑒定了與 m7GRLSig 相關的差異生物學途徑。我們發(fā)現(xiàn)細胞周期、嘌呤和嘧啶代謝途徑在高危人群中得到了豐富.?此外，核苷/核糖核苷三磷酸的代謝和生物合成過程、翻譯調節(jié)活性和核酸結合在具有高風險評分的 HCC 患者中顯著豐富。功能注釋進一步證實m7GRLSig模型可能與核酸代謝和基因修飾有關。

?免疫景觀與 m7GRLSig 之間的相關性

我們調查了 m7GRLSig 是否與 HCC 的免疫環(huán)境相關。實施CIBERSORT算法來比較兩個風險組之間免疫細胞的浸潤比例。在高風險組中觀察到更高比例的 M0 和 M2 巨噬細胞。相比之下，單核細胞、CD8+ T 細胞和活化的 NK 細胞主要浸潤低危組。大多數免疫檢查點基因（PDCD1、CD48、BTNL2、CD276等）在高危人群中顯著上調??基于 m7GRLSig 模型對單樣本基因集富集分析 (ssGSEA) 進行量化，以探索免疫細胞浸潤分數和功能。免疫細胞評分分析顯示，aDCs、DCs、iDCs、巨噬細胞、肥大細胞、Tfh 細胞、Th1/2 細胞和 Tregs 的浸潤分數在兩組之間存在顯著差異。APC 共刺激、CCR、檢查點、HLA、MHC I 類、副炎癥和 T 細胞共刺激的免疫功能在高風險組中被上調，而 II 型 IFN 反應在低風險組中被上調(圖 10d).?這些結果闡明了 m7GRLSig 在 HCC 免疫景觀中的作用。

藥物治療與 m7GRLSig 之間的相關性

我們進一步探討了 m7GRLSig 風險評分與藥物治療 HCC 療效之間的相關性。阿西替尼、拉帕替尼、吉非替尼和厄洛替尼對低 m7GRLSig 評分的患者更敏感（圖 11a–d)，而順鉑、博來霉素、依托泊苷和絲裂霉素對 m7GRLSig 評分較高的患者更敏感（圖 11e-h）。藥物-m7GRLSig 相關性分析表明，m7GRLSig 評分與對藥物的敏感性相關，表明 m7GRLSig 是 HCC 臨床治療的潛在預測因子。

敲低 NRAV 抑制 HCC 增殖和轉移并影響 METTL1 表達

如上所述，PIK3CD-AS2、AC092171.2、NRAV、ZFPM2-AS1 和 CASC19 是 m7GRLSig 模型中的危險因素；AC092171.2、NRAV 和 ZFPM2-AS1 的表達在 TCGA 隊列的腫瘤組織中顯著更高（補充圖 S4a-e）。qRT-PCR 分析顯示，與 L02 細胞相比，HCC 細胞系中 AC092171.2、NRAV 和 ZFPM2-AS1 的表達更高（圖 12a-c).?如圖所示圖 2c，這些 m7G 相關基因中的大多數與 NRAV 顯著相關，包括 METTL1，據報道 METTL1 通過 m7G 修飾作為最關鍵的調節(jié)因子促進 HCC 進展。因此，我們評估了 HCC 進展過程中 NRAV 和 METTL1 之間的關聯(lián)。與陰性對照相比，用 si-NRAV 處理的細胞中 NRAV mRNA 水平顯著降低（圖 12d).?Transwell 實驗表明，與陰性對照相比，si-NRAV 預處理的細胞中 Huh7 和 HepG2 細胞的遷移和侵襲能力受到抑制（圖 12e,f).?此外，與陰性對照相比，NRAV 的敲低顯著降低了 Huh7 和 HepG2 細胞的增殖（圖 12g-i）。鑒于 NRAV 和 METTL1 之間存在很強的正相關性（圖 12j)，我們推測 NRAV 也可能在 HCC 進展過程中調節(jié) METTL1 的表達。METTL1 的 mRNA 表達在 si-NRAV 預處理的 Huh7 和 HepG2 細胞中顯著下調（圖 12k,l）。NRAV 可能通過影響體外 METTL1 表達來正向調節(jié) HCC 進展。這些結果表明，m7GRLSig 中的預后 lncRNA 可能通過靶向 m7G 調節(jié)劑來調節(jié) HCC 進展過程中的 m7G 修飾。