流式細(xì)胞術(shù)廣泛用于分析細(xì)胞表面和細(xì)胞內(nèi)分子的表達(dá)、鑒定并確定異質(zhì)細(xì)胞群中的不同細(xì)胞類型、評估分離亞群的純度以及分析細(xì)胞大小和容積。這種技術(shù)可同時分析單個細(xì)胞的多個參數(shù)

主要用于測定熒光標(biāo)記的抗體檢測蛋白產(chǎn)生的熒光強度，或結(jié)合了特定細(xì)胞分子的配體，如碘化丙啶與 DNA 的結(jié)合。

其染色過程包括從細(xì)胞培養(yǎng)物或組織樣品制備單細(xì)胞懸液。然后將獲得的細(xì)胞培養(yǎng)在包含未標(biāo)記或熒光標(biāo)記抗體的試管或多孔板中，再用流式細(xì)胞儀分析。

流式細(xì)胞儀主要有兩型：

臨床型（又稱：小型機、臺式機）和綜合型（又稱：大型機、分析型）。BECKMAN-COULTER公司最新產(chǎn)品為EPICS ALTRA和EPICS XL/XL-MCL，B-D公司最新產(chǎn)品為FACS Vantage和FACS Calibur。EPICS XL/XL-MCL和FACS Calibur是臨床型；EPICS ALTRA和 FACS Vantage是綜合型，除具備檢測分析功能外，還具有細(xì)胞分選功能，多用于科學(xué)研究。

?

流式細(xì)胞儀主要技術(shù)指標(biāo)

1.流式細(xì)胞儀的分析速度：

一般流式細(xì)胞儀每秒檢測1000～5000個細(xì)胞，大型機可達(dá)每秒上萬個細(xì)胞；

2.式細(xì)胞儀的熒光檢測靈敏度：

一般能測出單個細(xì)胞上<600個熒光分子，兩個細(xì)胞間的熒光差＞5%即可區(qū)分；

3.前向角散射（FSC）光檢測靈敏度：

前向角散射（FSC）反映被測細(xì)胞的大小，一般流式細(xì)胞儀能夠測量到0.2μm～0.5μm；

4.流式細(xì)胞儀的分辨率：

通常用變異系數(shù)CV值來表示，一般流式細(xì)胞儀能夠達(dá)到<2.0%，這也是測量標(biāo)本前用熒光微球調(diào)整儀器時要求必須達(dá)到的；

5.流式細(xì)胞儀的分選速度：

一般流式細(xì)胞儀分選速度＞1000個/秒，分選細(xì)胞純度可達(dá)99%以上；

?

流式細(xì)胞儀：射流

圖 1.流式細(xì)胞儀概覽。鞘液使細(xì)胞懸液聚攏，依次通過激光束，一次僅一個細(xì)胞。檢測器會檢測前向和側(cè)向散射光，以及染色細(xì)胞發(fā)射的熒光。

當(dāng)細(xì)胞懸液通過流式細(xì)胞儀時，從小噴嘴中流出的細(xì)胞懸液在鞘液的流體力學(xué)作用下向中心聚攏。形成的細(xì)流可使細(xì)胞依次通過激光束，一次僅一個細(xì)胞（圖 1）。

當(dāng)細(xì)胞通過激光束時，檢測器會檢測細(xì)胞或顆粒的散射光。前面的檢測器檢測前向散射光 (FS)，放置在側(cè)面的多個檢測器檢測側(cè)向散射光 (SS)，熒光檢測器則檢測被染色的細(xì)胞或顆粒發(fā)射的熒光。

流式細(xì)胞儀：前向和側(cè)向散射光的測定

細(xì)胞或顆粒通過光束并使光散射，這些散射光將以 FS 或 SS 的形式檢測。FS 與細(xì)胞的大小相關(guān)，SS 則與細(xì)胞顆粒度成比例。因此，通常可根據(jù)細(xì)胞大小和顆粒度差異區(qū)分細(xì)胞群。

?

圖 2.綠色激光打到細(xì)胞上時的光散射。光的散射方向與細(xì)胞大小和顆粒度有關(guān)。

血液樣本流經(jīng)流式細(xì)胞儀的情況可有力地說明散射光與細(xì)胞的關(guān)系。

尺寸和顆粒度較大的粒細(xì)胞形成一個較大的細(xì)胞群，SS 和 FS 都很強，單核細(xì)胞尺寸較大，但其顆粒度較小，因此形成一個單獨的群，F(xiàn)S 較強但 SS 較弱，較小的淋巴細(xì)胞和淋巴母細(xì)胞也行成一個單獨的群，F(xiàn)S 較弱。由于這兩種細(xì)胞都不是顆粒細(xì)胞，因此產(chǎn)生的 SS 也較弱。

因此，根據(jù)不同的 FS 和 SS 可將這些細(xì)胞分成不同的細(xì)胞群。

圖 3.FS?與 SS?散點圖。每一個散點到代表被流式細(xì)胞儀檢測到的一個單細(xì)胞，不同細(xì)胞群的特征位置依據(jù)細(xì)胞大小和顆粒度確定。參考圖片出處：Riley 和 Idowu，Principles and Applications of Flow Cytometry（流式細(xì)胞術(shù)的原理和應(yīng)用）*。

流式細(xì)胞儀：散射光和熒光的測定

與根據(jù) FS 和 SS 區(qū)分細(xì)胞群類似，可根據(jù)是否表達(dá)特定蛋白區(qū)分細(xì)胞。這種情況下，通常使用熒光染料對目標(biāo)蛋白進(jìn)行染色。用于檢測目標(biāo)蛋白的熒光染料被相應(yīng)激發(fā)波長的激光激發(fā)后會發(fā)射熒光。這些被熒光染色的細(xì)胞或顆粒會被單獨檢測。

受流式細(xì)胞儀中一組濾光片和鏡子的作用，前向和側(cè)向散射光以及染色細(xì)胞發(fā)射的熒光會被分成既定的波長并分配通道。熒光會被過濾，以使各傳感器僅檢測特定波長的熒光。這些傳感器稱為光電倍增管 (PMT)。

圖 4.熒光會被過濾，以使各 PMT?僅檢測特定波長的光。PMT?會將光子能量轉(zhuǎn)換成電信號，即電壓。

如圖 4 所示，F(xiàn)ITC（異硫氰酸熒光素）通道中，PMT 僅檢測 FITC 發(fā)射的波長在 519 nm 附近的光。PE 通道中，PMT 僅檢測 PE（藻紅蛋白）發(fā)射的波長在 575 nm 附近的光。各 PMT 還會檢測其他的熒光染料，這些染料發(fā)射的熒光波長與其要檢測的熒光染料發(fā)射的熒光波長相似。

流式細(xì)胞儀中裝有一組濾光片，以將相應(yīng)波長的光子引導(dǎo)至特定的 PMT 上（圖 5）。

圖 5.流式細(xì)胞儀中的濾光片。帶通 (BP)?濾光片允許較小范圍波長的光子通過，短通 (SP)?濾光片允許特定波長以下的光子通過，

長通 (LP) 濾光片則允許特定波長以上的光子通過。雙色向濾光片/鏡子（如雙色向 LP 鏡子）面向光束 45° 角放置。

對于長通雙色向濾光片，特定波長以上的光子可直接通過，特定波長以下的光子成 90° 角反射。

信號測定

當(dāng)帶熒光的細(xì)胞通過激光束時，會隨著時間產(chǎn)生發(fā)射光峰或脈沖。它們將被 PMT 檢測并轉(zhuǎn)換成電壓脈沖，這就是事件。流式細(xì)胞儀會檢測總脈沖高度和面積，并將測得的電壓脈沖直接與該事件的熒光強度相關(guān)聯(lián)。

圖 6.PMT?將檢測熒光細(xì)胞每次釋放的光子產(chǎn)生的電壓脈沖面積。當(dāng)沒有熒光標(biāo)記的細(xì)胞通過光學(xué)元件時，不會發(fā)射光子，也不會檢測到信號。當(dāng)熒光標(biāo)記的細(xì)胞通過光學(xué)元件時，會受到激光照射并發(fā)射光子，因此檢測到的電壓強度會逐漸增強。隨著熒光細(xì)胞逐漸通過激光束，會隨著時間變化產(chǎn)生一段電壓脈沖。

通過積分各時刻脈沖的高度值得到脈沖面積，這由模數(shù)轉(zhuǎn)換器 (ADC) 的速度決定，也就是 10 MHz（即每秒 1000 萬次或每微秒 10 次）。

依據(jù)事件的脈沖強度（脈沖面積）為事件分配通道。增大通過 PMT 的電壓可以對信號進(jìn)行放大。

圖 7.利用通道號和事件數(shù)繪制的單參數(shù)直方圖。X?軸為用對數(shù)表示的通道。

根據(jù)測得的信號強度為每一事件分配通道號；熒光強度越高，事件的通道號就越大。

圖 8.陰性和陽性結(jié)果的熒光強度測定值。左側(cè)的陰性結(jié)果表明沒有染色的細(xì)胞且各事件的熒光強度都很低，右側(cè)的陽性結(jié)果表明存在大量熒光強度很高的事件。

在陽性結(jié)果中，可以看出陰性對照和陽性樣品間強度結(jié)果有所不同（圖 9）。

圖 9.人 PBMC 細(xì)胞對單核細(xì)胞設(shè)門的抗-CCR2 抗體 (ab21667)?染色結(jié)果。數(shù)據(jù)來自匿名?Abreview

抗體染色

直接染色：
在直接免疫熒光染色中，將細(xì)胞與直接偶聯(lián)到熒光染料（如 FITC）的抗體一同培養(yǎng)。該染色法僅需一步抗體培養(yǎng)，且消除了二抗的非特異性結(jié)合。

對于包含二抗的大型抗體 - 熒光染料復(fù)合物可能被捕獲而導(dǎo)致非特異性結(jié)合或無法進(jìn)入細(xì)胞防止一抗檢測的細(xì)胞內(nèi)染色非常適用。

?

間接染色：
在間接染色中，一抗未用熒光標(biāo)記，而是通過熒光標(biāo)記的二抗進(jìn)行檢測。第二種試劑可以是能與一抗特異性結(jié)合的抗體。此外，還可使用親和素 - 生物素體系，這種方法將抗體偶聯(lián)到生物素上，再通過熒光染料標(biāo)記的親和素進(jìn)行檢測。

由于目前可用的偶聯(lián)抗體種類很多，這種方法可以將多種不同靶標(biāo)產(chǎn)生的未偶聯(lián)一抗用于與熒光標(biāo)記的二抗結(jié)合，以進(jìn)行 FACS 分析。這大大提高了研究人員的可選靶標(biāo)蛋白范圍。

?

細(xì)胞內(nèi)染色：
用于流式細(xì)胞術(shù)的細(xì)胞內(nèi)抗原染色方案取決于可讓抗體接近內(nèi)部細(xì)胞蛋白的固定和透化方法。無論何種情況，成功的染色都離不開通過抗體滴定進(jìn)行的實驗條件優(yōu)化、使用適合的對照正確設(shè)置流式細(xì)胞儀以及優(yōu)化的固定和透化步驟。

?

分泌蛋白的檢測：
分泌蛋白的檢測十分困難，因為蛋白會在檢測前從細(xì)胞中釋放出來且可能快速降解。高爾基體阻斷劑（如布雷非德菌素A）可用于抑制表達(dá)蛋白的分泌，使其仍保留在高爾基體中。然后再用細(xì)胞內(nèi)染色法檢測靶標(biāo)蛋白。

熒光染料偶聯(lián)劑的選擇

給定的抗體能否從陰性信號中分辨陽性信號取決于所用的熒光染料偶聯(lián)劑。

各熒光染料的相對強度一般指導(dǎo)原則是，從亮到暗依次為：PE、PE-Cy 7、PE-Cy5、APC、APC-Cy7、Alexa Fluor 647?、Alexa Fluor 700?、FITC、Pacific Blue 和 Alexa Fluor 488?。這是一般排序，個別抗體的相對強度可能有所差異。

高度表達(dá)的抗原通常可被檢測且與陰性對照區(qū)分開來，無論使用何種熒光染料。表達(dá)較少的抗原需要較亮的 PE 或 APC 偶聯(lián)劑提供的高信號背景比，以將陽性細(xì)胞完全從未染色的細(xì)胞中區(qū)分開來。

相對熒光染料強度取決于使用的儀器，因為不同儀器中的激光和濾光片組合會有所差異。因此，需要確保選用了合適的 FACS 儀器。

廣州甄鈺科技有限公司秉持“至臻品質(zhì)，至善服務(wù)”的信念，專注生命科學(xué)領(lǐng)域產(chǎn)品的制造，專業(yè)從事高端生物耗材生產(chǎn)和銷售，創(chuàng)立自主品牌“ZENETIX”，實施標(biāo)準(zhǔn)化產(chǎn)品作業(yè)及嚴(yán)格的科學(xué)管理體制，嚴(yán)把質(zhì)量關(guān)，不斷追求完美的品質(zhì)以及高效的服務(wù)，產(chǎn)品嚴(yán)格按照IS013485的醫(yī)療器械質(zhì)量管理標(biāo)準(zhǔn)生產(chǎn)，并通過FDA和CE雙重質(zhì)量體系認(rèn)證。堅持以客戶需求為核心，致力于為科研用戶提供行業(yè)領(lǐng)先的液體處理、分子檢測、細(xì)胞培養(yǎng)等方面的高品質(zhì)一站式科研耗材服務(wù)。旗下細(xì)胞培養(yǎng)板精選優(yōu)質(zhì)聚苯乙烯材料，具有高透明度，易于顯微鏡觀察。

特點：

*優(yōu)質(zhì)聚苯乙烯材料，品質(zhì)可靠，耐化學(xué)藥品腐蝕，適用于多種細(xì)胞培養(yǎng)

*板邊獨特防滑設(shè)計，方便握取

*電子束滅菌處理，杜邦特衛(wèi)強紙易撕獨立無菌盒裝設(shè)計，防潮防水，有效減少污染幾率

*TC處理，有效提高細(xì)胞的粘附和伸展效果

*每孔均編碼標(biāo)識，便于區(qū)分識別，方便記錄

*無熱源，無內(nèi)毒素，無Dnase/Rnase

*產(chǎn)品批號標(biāo)識，便于質(zhì)量追溯

?