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資料來源：生物不研究所研究員

中華蟾蜍(Bufo gargarizans)隸屬蟾蜍科蟾蜍屬，俗名“癩蛤蟆”， 是我國最常見也最為人所熟知的兩棲動物。蟾蜍在我國的傳統(tǒng)文化中占有重要的地位，在神話傳說中，蟾蜍是嫦娥的化身，和玉兔一起居住在月亮上，因此月亮也被歷代文人稱為“蟾宮”，蟾蜍被稱為“月精”。蟾蜍自古以來都是美好意愿的象征。中秋佳節(jié)，各家各戶焚香拜月，祈愿蟾宮折桂，平步青云；家庭美滿，圓如皓月。蟾蜍也是招財進(jìn)寶的吉祥物被供奉于家家戶戶。此外，蟾蜍有較高的醫(yī)藥研究價值，其耳后腺和背部皮膚的分泌物有較強的毒性，成分復(fù)雜，主要是強心甾類化合物和生物堿，統(tǒng)稱為蟾蜍毒素(Bufotoxin)，有麻醉止痛的功效。

蟾蜍科(Bufonidae)物種的分布非常廣泛，在除了澳大利亞、馬達(dá)加斯加與南極洲以外的各大洲都有分布，可以說是最成功的兩棲動物類群。甘蔗蟾蜍（Rhinella marina）在被人為引入澳洲后迅速入侵土著物種的生境，泛濫成災(zāi)，造成了嚴(yán)重的生態(tài)系統(tǒng)破壞。中華蟾蜍在我國分布十分廣泛，從島嶼到高原都有其足跡，其食性廣泛，能適應(yīng)各種不同的生境，強烈的毒性也讓許多潛在的捕食者（蛇類等）望而卻步。蟾蜍廣布適應(yīng)性的遺傳機制目前還不清楚，通過基因組測序和組裝可以幫助我們更好的了解這一重要的物種。相較其它動物，兩棲動物的基因組破譯是非常困難的，這主要是由于其基因組普遍較大，無尾兩棲類(anurans)基因組大小多數(shù)范圍在2到8Gb之間，蚓螈(caecilians)多數(shù)達(dá)到~5-10 Gb，蠑螈(salamanders)?更是多數(shù)高達(dá)~20-60 Gb，基因組最大的是一種洞螈(Necturus lewisi)，為137Gb。另外，重復(fù)序列占比較高也是造成測序和組裝困難的主要原因之一。因此，目前兩棲動物的基因組數(shù)量較少，而且多數(shù)組裝呈高度片段化，質(zhì)量不佳。近幾年發(fā)展成熟的長片段測序技術(shù)能夠跨過較長的重復(fù)區(qū)域，結(jié)合基因組輔助組裝技術(shù)有望得到較高質(zhì)量的兩棲類基因組。

為了揭秘中華蟾蜍的適應(yīng)性遺傳機制，中科院成都生物所呂彬，江建平和傅金鐘主導(dǎo)，聯(lián)合國內(nèi)多所高?？蒲腥藛T，包括華中師大吳華，河南師大陳曉紅，信陽師大宋曉威和西華師大廖文波共同發(fā)起了中華蟾蜍基因組測序項目，成功破譯中華蟾蜍基因組，獲得首個組裝到染色體水平的蟾蜍基因組參考圖譜。項目于2018年啟動，2019年完成基因組測序，2020年完成數(shù)據(jù)分析并投出論文，研究成果于2021年1月發(fā)表于一區(qū)SCI期刊Molecular Ecology Resources。

主要研究成果：

研究利用了4種最新的測序組裝技術(shù)來構(gòu)建參考基因組，包括PacBio長讀長測序(103X), BioNano光學(xué)圖譜(137X), 10x genomeics (130X)和Hi-C染色體構(gòu)象捕獲技術(shù)(176X)，總計產(chǎn)生了近3Tb的測序數(shù)據(jù)量。最終基因組組裝大小約4.55Gb，僅由747條scaffolds構(gòu)成(熱帶爪蟾Xenopus tropicalis中為6,822條)，Scaffold N50達(dá)到539.8 Mb，gap占比僅為1.79%?，96%的序列可以定位到11條染色體上(圖1A和圖2A)。比較發(fā)現(xiàn)中華蟾蜍與熱帶爪蟾的基因組染色體之間具有良好的共線性，推測至少經(jīng)歷過1次染色體融合和3次分裂事件(圖3A)。中華蟾蜍基因組是目前兩棲動物中連續(xù)性最好的參考基因組(圖1B-D)，為兩棲動物的基因進(jìn)化和功能以及遺傳學(xué)研究提供了重要的理論支撐。

蟾蜍基因組中重復(fù)序列占比為65.5%，大部分為長末端重復(fù)(LTR)序列，這與墨西哥鈍口螈(Ambystoma mexicanum)中的發(fā)現(xiàn)較為近似，其基因組大小約為32Gb。推測LTR反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)座復(fù)制產(chǎn)生的大量拷貝可能是兩棲類基因組巨大的重要原因。基因結(jié)構(gòu)注釋和比較發(fā)現(xiàn)越大的基因組擁有較長的基因間區(qū)和內(nèi)含子，外顯子長度在不同物種間較為保守(圖2B)。

研究發(fā)現(xiàn)中華蟾蜍中具有超多的多拷貝基因，在斑馬魚、甘蔗蟾蜍和墨西哥鈍口螈中也存在類似的狀況。我們知道斑馬魚經(jīng)歷了硬骨魚全基因組加倍事件，基因復(fù)制數(shù)目在本研究物種中確實是最多的；而墨西哥鈍口螈基因組是現(xiàn)今完成測序的最大的動物基因組,也發(fā)生了較多的基因復(fù)制事件；甘蔗蟾蜍和中華蟾蜍隸屬蟾蜍科，都是“真蟾蜍”，大多數(shù)復(fù)制都是局部發(fā)生。中華蟾蜍中的基因復(fù)制方式以串聯(lián)(TD)和近端復(fù)制(PD)為主,并且TD和PD受到的正選擇壓力顯著高于其他復(fù)制方式(圖3B和C)，推測這兩種復(fù)制方式可能與其環(huán)境適應(yīng)性有關(guān)。

根據(jù)以上推斷，我們進(jìn)而分析了中華蟾蜍基因組中基因家族的擴張狀況，發(fā)現(xiàn)有122個基因家族發(fā)生了顯著的擴張(圖4)，化學(xué)感受基因家族顯著富集，包括嗅覺和苦味受體基因。相比而言，中華蟾蜍的中性替換速率并不高，處于中間水平，但是其祖先卻經(jīng)歷了快速的進(jìn)化過程(圖4)。

和其他脊椎動物類似，兩棲動物同樣擁有數(shù)目龐大的嗅覺基因(800~1400?ORs?this studyA)，有功能的嗅覺基因占比60%~70%，眾多的基因數(shù)目說明嗅覺對兩棲動物的生存是比較重要的。中華蟾蜍中共鑒定出1013個嗅覺基因(圖5A和B)，765個是完整可能有功能的，占比較高(~76%)。從功能和變化趨勢來說，蟾蜍感受空氣中化學(xué)分子的嗅覺基因增多且功能基因比例升高，水中則相反。信息素受體在種內(nèi)和種間通訊中扮演著重要的角色，研究在蟾蜍中鑒定到5個完整的信息素受體1(V1Rs)但沒發(fā)現(xiàn)假基因，4個完整的信息素受體2(V2Rs)和33個假基因(圖5C)。V1Rs負(fù)責(zé)檢測空氣中揮發(fā)的小分子，V2Rs檢測水中的。多物種比較傾向支持從水到陸驅(qū)動的動態(tài)進(jìn)化假說。

苦味受體能幫助動物感知食物是否有毒。苦味受體(TAS2Rs)在“真蟾蜍”中發(fā)生過3次急劇的擴張(圖5D)，形成了130多個功能基因，分布在1，4, 6, 8和11號染色體上。與其他無尾目物種相比，其家族成員數(shù)目是最多的，完整基因的比例也是最高的(~80%)。蟾蜍分布廣且食性雜，大量的苦味受體有助于提高毒素檢測的能力。無獨有偶，先前關(guān)于美國白蛾入侵機制的研究(Wu et. al 2019)同樣發(fā)現(xiàn)了苦味受體的顯著擴張。

蟾蜍利用毒素進(jìn)行防御，但其如何避免自中毒是個有意思的話題。我們發(fā)現(xiàn)細(xì)胞色素P450基因家族中起代謝解毒作用的CYP2C亞家族在“真蟾蜍”中發(fā)生了顯著擴張(圖6A)，中華蟾蜍中產(chǎn)生了39個基因，甘蔗蟾蜍中有35個，而其他無尾類都只有約一半的成員數(shù)。聚類分析發(fā)現(xiàn)了蟾蜍枝系特異性的CYP2C擴張(圖6A)，分布在中華蟾蜍5號染色體上一段約3Mb的區(qū)域內(nèi)(圖6B)，通過PD (近端)和TD?(串聯(lián)復(fù)制)方式形成。這些擴張的家族成員應(yīng)是在祖先物種中就已經(jīng)形成了。

離子通道基因在防止自中毒過程中發(fā)揮著重要的作用。舉一個著名的例子，箭毒蛙的煙堿乙酰膽堿受體只發(fā)生了1到2個位置的氨基酸替代就進(jìn)化出了毒素耐受性(2017 Tarvin et. al)。我們發(fā)現(xiàn)一種煙堿乙酰膽堿受體CHRNE在中華蟾蜍，甘蔗蟾蜍和草莓箭毒蛙基因組中都產(chǎn)生了2個拷貝(圖7B)，通過串聯(lián)復(fù)制產(chǎn)生，可能和抗生物堿毒性有關(guān)。此外，研究發(fā)現(xiàn)在“真蟾蜍”的鈉鉀離子泵基因的關(guān)鍵毒素結(jié)合區(qū)存在很多獨有的氨基酸突變(圖7A)，先前實驗證明有的位點突變能顯著鑒定毒素結(jié)合敏感性，降低程度甚至能達(dá)到1000倍以上。有意思的是，這些關(guān)鍵區(qū)域的氨基酸位點在中華蟾蜍和甘蔗蟾蜍中是完全一致的，說明受到較強的功能限制。進(jìn)化分析表明，相對其他物種，“真蟾蜍”?鈉鉀離子泵基因的經(jīng)歷了快速的進(jìn)化并受到正選擇壓力。

此外，研究發(fā)現(xiàn)6個與牙齒(牙釉質(zhì)和牙本質(zhì))形成相關(guān)的基因在“真蟾蜍”祖先中就已經(jīng)丟失(圖8)。這和無齒的龜、鳥類、須鯨一致，但都是獨立丟失的，說明四足動物牙齒形成機制是比較保守的。

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