老司機帶你解鎖ImageJ劃痕實驗寬度分析！手把手教你
傷口愈合實驗（Wound healing assay）是一種操作簡單、經(jīng)濟實惠的研究細胞遷移/腫瘤侵襲的體外試驗方法，在SCI論文中得到了廣泛的使用【1】。
如何分析劃痕實驗結(jié)果卻令很多人頭疼！劃痕實驗常見的統(tǒng)計指標(biāo)是統(tǒng)計傷口愈合百分比（Wound healing percentage）和劃痕寬度。傷口愈合百分比本質(zhì)上是一種面積分析，半夏在往期已經(jīng)給大家分享過30秒搞定劃痕面積分析，有興趣的童鞋可以自行查看！
劃痕面積的基本分析步驟為：對劃痕圖片進行Process -> smooth平滑后進行Process -> Find Edges尋找邊緣，再使用Image -> Adjust -> Threshold，閾值選定后進行劃痕面積分析：
劃痕面積的分析相信大家已經(jīng)很熟悉了，然而使用ImageJ分析實驗劃痕寬度卻困難重重！在網(wǎng)絡(luò)上我注意到有很多人都對劃痕寬度計算心存疑惑：
關(guān)于寬度計算目前常用的方法是使用Plugins -> Analyze -> Grid添加等距的水平線（Horizontal lines）或是垂線，再沿著水平線或是垂直線手動畫出劃痕寬度，再使用Analyze -> Measure進行計算：
這種方法存在缺點：
手動畫線起點和終點欠精確；添加的等距水平線數(shù)量有限，得到的平均寬度不準確；工作量大，浪費時間。
01、基礎(chǔ)知識準備
(1)灰度值灰度值純黑為0、純白為255：
（2）Plot Profile
Plot Profile（快捷鍵 Ctrl+K）見于Analyze -> Plot Profile，適用于線和矩形選框，表示線段和矩形選框所經(jīng)過的范圍內(nèi)的灰度變化（熒光強度），如下圖：
Plot Profile常用于定性表示熒光共定位【2】與矩形范圍內(nèi)熒光強度變化【3】：
02、劃痕寬度分析
（1）劃痕面積分析
1. ImageJ打開待分析劃痕圖片，先通過Image -> Type -> 8-bit將圖片格式轉(zhuǎn)化為8-bit灰度圖片，再通過Process -> smooth將圖片進行平滑處理，最后點擊Process -> Find Edges尋找邊緣：
2. Process -> Filters -> Gaussian Blur…Sigma設(shè)為6，對圖片進行模糊處理：
3. Image -> Adjust -> Threshold，按照自己需要調(diào)整適合的閾值，調(diào)整合適后點擊Apply：
此時得到的圖片黑色灰度值為0，白色灰度值為255。
4. 使用魔棒工具選擇劃痕，Edit -> Clear清除劃痕內(nèi)部的細胞，然后使用Edit -> Clear outside去除非劃痕部分的白色空隙。Edit -> Invert將劃痕轉(zhuǎn)變?yōu)榛疑?，再次對整張圖片進行反轉(zhuǎn)，得到劃痕為白色、非劃痕部分為黑色：
5. 驗證所得劃痕面積的準確性
利用魔術(shù)棒點擊白色區(qū)域，點擊Analyze -> Tools -> ROI Manager…-> Add，打開原圖片，點擊ROI Manager中剛剛Add的區(qū)域，此區(qū)域?qū)@示在原圖片中，通過符合程度返回第3步調(diào)整閾值，調(diào)整目的區(qū)域：
（2）劃痕寬度計算
將得到上步驟得到黑白劃痕圖片使用Image -> Transform -> Rotate 90 Degrees Right/Left進行旋轉(zhuǎn)：
2. Edit -> Selection -> Select All全選整個圖片。點擊Analyze -> Plot Profile，再點擊結(jié)果左下角的List，點擊新彈出窗口中Edit -> Copy，復(fù)制所有數(shù)據(jù)，粘貼至新建Excel中：
3. 劃痕寬度分析思路
Plot Profile得到的Gray value變化是整張圖片從左往右對應(yīng)的每個高度的灰度值的平均值。黑色灰度值為0，白色灰度值（代表劃痕）為255，僅有白色范圍可以影響平均灰度值。
示例劃痕圖片長寬為460*500 pixels，則有460條豎直線覆蓋圖片，下圖X為豎直線編號。劃痕寬度乘以255除以500即對應(yīng)平均灰度值。反之利用利用公式：(Y*500)/255就可以得到整條線上白色的區(qū)域的長度（500為一條線的總長度），也就是劃痕寬度：
進一步可以求每張劃痕的平均寬度。值得注意的是，本次計算劃痕寬度沒有進行標(biāo)尺校正操作，故得到的寬度單位為像素。在Analyze -> Set Scale進行標(biāo)尺校正后可以得到其實際距離。
最后，檢查一下所求寬度是否和實際相符：
03、總結(jié)
利用對二值化圖片進行Plot Profile操作，我們便捷、準確的獲取了劃痕對應(yīng)的每一個像素的寬度，這提示我們在日常的科研生活中應(yīng)該勤于思考、做到舉一反三！今天的給大家分享ImageJ高效分析劃痕寬度就到此為止了，希望對大家有所幫助！
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