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前言

在生物制藥產(chǎn)業(yè)的各個工段中，發(fā)酵流程處于最前端也是最基礎(chǔ)的位置，并對整個生產(chǎn)流程產(chǎn)生重要的影響。其中發(fā)酵流程中最為重要的就是前期的滅菌處理，這也是避免噬菌體感染的最主要方法。

了解各種滅菌方法對于項目的有效推進有重大的意義，今天菌菌就和大家一起了解在發(fā)酵流程中最為常用的幾種滅菌方法。

常用的消毒滅菌方法主要有：熱滅菌法（干熱、濕熱、火焰）、輻射滅菌法、化學(xué)藥品滅菌法、臭氧滅菌法、過濾除菌法等。

在發(fā)酵工業(yè)中經(jīng)常需要對某些物品或產(chǎn)品以及使用和生產(chǎn)這些物品或產(chǎn)品所需的原輔料、包裝材料、設(shè)備、工器具、生產(chǎn)設(shè)施與環(huán)境進行必要的消毒和滅菌，甚至包括操作人員同樣需要采取必要的消毒與滅菌措施，以確保經(jīng)消毒與滅菌后的物品或產(chǎn)品符合規(guī)定的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

消毒與滅菌在發(fā)酵工業(yè)中均有廣泛應(yīng)用。消毒是指用物理或化學(xué)方法殺死物料、容器、器具內(nèi)外的病源微生物。一般只能殺死營養(yǎng)細胞而不能殺死細菌芽孢。例如，用于牛奶、啤酒和釀酒原汁等的巴氏消毒法，是將物料加熱至60℃維持30min，以殺死不耐高溫的物料中的微生物營養(yǎng)細胞。滅菌是用物理或化學(xué)方法殺死或除去環(huán)境中所有微生物，包括營養(yǎng)細胞、細菌芽孢和孢子。消毒不一定能達到滅菌要求，而滅菌則可達到消毒的目的。

一、火焰滅菌法

直接在火焰上灼燒滅菌，該方法簡單有效，但局限性很大。（1）適用于接種針、玻璃棒、試管口、三角瓶等無菌操作，需要與酒精燈配合使用；（2）適用于各類不易染菌或?qū)θ揪刂埔蟛皇翘貏e嚴(yán)格的接種操作，比如酵母類接種大多數(shù)即可用火焰保護接種，需與火焰圈配合使用。

二、干熱滅菌法

干熱滅菌主要運用微生物細胞在高溫條件下發(fā)生氧化，微生物體內(nèi)蛋白質(zhì)變性和電解質(zhì)濃縮引起中毒等作用而導(dǎo)致微生物死亡。干熱滅菌所需的溫度較高，時間較長，一般160-170℃，1-1.5h。實際應(yīng)用時，對一些要求保持干燥的實驗器具和材料可以采用干熱滅菌法。一般有火焰滅菌法和干熱空氣滅菌法。

三、濕熱滅菌法

濕熱滅菌通常利用飽和蒸汽進行滅菌。其原理是借助于蒸汽釋放的熱能使微生物細胞中的蛋白質(zhì)、酶和核酸分子內(nèi)部的化學(xué)鍵，特別是氫鍵受到破壞，引起不可逆的變性，使微生物死亡。由于蒸汽有很強的穿透能力，濕熱蒸汽存在潛熱。蒸汽來源方便，價格低廉，滅菌效果可靠，是目前最為常用的滅菌方法。一般的濕熱滅菌條件為121 ℃，30 min。然而巴氏消毒法通產(chǎn)是加熱到62℃，經(jīng)過30分鐘，以殺死不耐高溫的物質(zhì)中的微生物和病原體的消毒法。牛奶、啤酒、黃酒、醬油和醋等用此法消毒。

四、輻射滅菌法

輻射滅菌是利用高能量的電磁輻射和微粒輻射來殺死微生物，以紫外線最常用。紫外線對芽孢和營養(yǎng)細胞都能起作用，但細菌芽孢和霉菌孢子對紫外線的抵抗力強。紫外線的穿透力低，且距照射物不超過1.2 m；對固體物料滅菌不徹底，也不能用于液體物料的滅菌。

射線滅菌適用范圍比較局限，該滅菌方法只能達到表面滅菌的效果，一般適用于無菌室，無菌箱、器皿表面及超凈工作臺等的消毒，由于此類環(huán)境中常有目標(biāo)菌及工作菌的存在，我們需要在保證工作菌或目標(biāo)菌活性的前提下對環(huán)境雜菌進行控制。

五、化學(xué)藥品滅菌法

化學(xué)藥品滅菌法指運用某些化學(xué)藥品與微生物發(fā)生反應(yīng)而導(dǎo)致微生物蛋白變性、酶失活以及細胞通透性改變而死亡?；瘜W(xué)藥劑適于生產(chǎn)車間環(huán)境的滅菌，接種操作前小型器具的滅菌等，不適用于培養(yǎng)基。化學(xué)藥品的滅菌使用方法，根據(jù)滅菌對象的不同有浸泡、添加、擦拭、噴灑、氣態(tài)熏蒸等。常用化學(xué)藥品有高錳酸鉀溶液、漂白粉、乙醇、新潔爾滅和杜滅芬、甲醛、戊二醛、過氧乙酸、焦碳酸二乙酯、酚類等。

化學(xué)滅菌法可分為兩類：

化學(xué)氣體滅菌法的揮發(fā)性質(zhì)，可使滅菌氣體到達封閉空間的各個細微角落，常用于環(huán)境空氣的滅菌及一些表面的滅菌，如：高錳酸鉀滅菌法、甲醛熏蒸法；

化學(xué)液體滅菌法在生物行業(yè)最常用的是75%酒精的使用，此類方法對人體的傷害較小，因而得以廣泛使用。

六、臭氧滅菌

臭氧滅菌主要是利用臭氧氧化分解微生物內(nèi)部氧化葡萄糖所需要的酶，并破壞細胞膜，殺死細菌。在GMP驗證過程中我們大力推薦臭氧滅菌方法。臭氧滅菌有許多特點：臭氧為氣體，能迅速彌漫到整個滅菌空間，滅菌無死角，濃度分布均勻；臭氧滅菌為溶菌級方法，殺菌徹底，殺菌能力與過氧乙酸相當(dāng)，高于其它消毒劑；臭氧廣譜殺菌，可殺滅細菌繁殖體和芽孢、病毒、真菌等， 并可破壞肉毒桿菌毒素，另外，臭氧對霉菌也有極強的殺滅作用。

臭氧制備是利用我們周圍的大氣制?。ǔ粞醢l(fā)生器），現(xiàn)制現(xiàn)用，不需儲藏設(shè)施，節(jié)省原料儲儲所需的占地面積。臭氧主要用于潔凈室、凈化設(shè)備的消毒。

七、過濾除菌

過濾除菌指用適當(dāng)?shù)倪^濾材料對液體或氣體進行過濾除去微生物。此法主要用于熱敏性物質(zhì)的滅菌和發(fā)酵用無菌空氣的制備。該除菌方法有兩個應(yīng)用方向：

（1）物料除菌：發(fā)酵培養(yǎng)基的成分需要添加適量維生素，而維生素本身不耐高溫，此時可通過濾頭過濾雜菌達到無菌目的（PS.濾頭方案僅適用于實驗室規(guī)模）；

（2）環(huán)境除菌：無菌空間的滅菌方案除了上述的化學(xué)氣體之外，一般還需提請進行空氣過濾除菌，尤其是對大型無菌空間環(huán)境。

常用的過濾除菌有絕對介質(zhì)過濾和深層介質(zhì)過濾：絕對介質(zhì)過濾的介質(zhì)濾孔小于細胞和孢子。一般采用0.2微米微孔濾膜。深層介質(zhì)過濾介質(zhì)的孔隙一般大于微生物細胞，如用棉花、玻璃纖維和顆粒活性炭填充的過濾器。其原理為當(dāng)微粒隨氣流通過濾層時，由于濾層纖維的層層阻礙，使氣流出現(xiàn)無數(shù)次改變運動速度和方向的繞流運動，引起微粒與濾層纖維間產(chǎn)生慣性沖擊、攔截、布朗擴散、重力沉降、靜電引力等作用把微粒滯留在纖維表面上，實現(xiàn)過濾的目的。

總結(jié)

在進行發(fā)酵操作之前對物料、設(shè)備、人員進行良好的消毒滅菌處理對后續(xù)的發(fā)酵以及其他生產(chǎn)階段都有益處。在很多產(chǎn)生噬菌體感染的案例中，最主要的原因就是消毒滅菌能力不夠?qū)е孪緶缇粡氐祝M而影響整體項目的進展。

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